Respuesta cardíaca a la estimulación β-adrenérgica determinada por análisis de asa presión-volumen
Summary
Aquí describimos un análisis de asa presión-volumen cardíaco bajo dosis crecientes de isoproterenol infundido por vía intravenosa para determinar la función cardíaca intrínseca y la reserva β-adrenérgica en ratones. Utilizamos un enfoque de pecho abierto modificado para las mediciones de bucle presión-volumen, en el que incluimos ventilación con presión positiva al final de la espiración.
Abstract
La determinación de la función cardíaca es un análisis de punto final robusto en modelos animales de enfermedades cardiovasculares con el fin de caracterizar los efectos de tratamientos específicos en el corazón. Debido a la viabilidad de las manipulaciones genéticas, el ratón se ha convertido en el modelo animal de mamíferos más común para estudiar la función cardíaca y buscar nuevas dianas terapéuticas potenciales. Aquí describimos un protocolo para determinar la función cardíaca in vivo utilizando mediciones y análisis de asa presión-volumen durante condiciones basales y bajo estimulación β-adrenérgica por infusión intravenosa de concentraciones crecientes de isoproterenol. Proporcionamos un protocolo refinado que incluye soporte de ventilación teniendo en cuenta la presión positiva al final de la espiración para mejorar los efectos negativos durante las mediciones de tórax abierto, y analgesia potente (buprenorfina) para evitar el estrés miocárdico incontrolable evocado por el dolor durante el procedimiento. En conjunto, la descripción detallada del procedimiento y la discusión sobre posibles escollos permite un análisis de bucle presión-volumen altamente estandarizado y reproducible, reduciendo la exclusión de animales de la cohorte experimental al prevenir posibles sesgos metodológicos.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares suelen afectar la función cardíaca. Este número señala la importancia de evaluar in vivo la función cardíaca detallada en modelos de enfermedades animales. La experimentación animal está rodeada por un marco de los tres principios rectores de las Tres R (3R) (Reducir/Refinar/Reemplazar). En caso de comprender patologías complejas que involucran respuestas sistémicas (es decir, enfermedades cardiovasculares) en el nivel de desarrollo actual, la opción principal es refinar los métodos disponibles. El refinamiento también conducirá a una reducción del número de animales requerido debido a una menor variabilidad, lo que mejora el poder del análisis y las conclusiones. Además, la combinación de mediciones de contractilidad cardíaca con modelos animales de enfermedad cardíaca, incluidos los inducidos por estimulación neurohumoral o por sobrecarga de presión como bandas aórticas, que imita, por ejemplo, los niveles alterados de catecolaminas / β-adrenérgicos1,2,3,4, proporciona un método poderoso para estudios preclínicos. Teniendo en cuenta que el método basado en catéter sigue siendo el enfoque más utilizado para la evaluación en profundidad de la contractilidad cardíaca5, nuestro objetivo fue presentar aquí una medición refinada de la función cardíaca in vivo en ratones mediante mediciones de asa de presión-volumen (PVL) durante la estimulación β-adrenérgica basada en la experiencia previa, incluida la evaluación de parámetros específicos de este enfoque6, 7.
Para determinar los parámetros hemodinámicos cardíacos se dispone de enfoques que incluyen técnicas basadas en imágenes o catéteres. Ambas opciones van acompañadas de ventajas y desventajas que deben considerarse cuidadosamente para la cuestión científica respectiva. Los enfoques de imágenes incluyen ecocardiografía y resonancia magnética (MRI); ambos se han utilizado con éxito en ratones. Las mediciones ecocardiográficas implican altos costos iniciales de una sonda de alta velocidad requerida para la alta frecuencia cardíaca de los ratones; es un enfoque no invasivo relativamente sencillo, pero es variable entre los operadores que idealmente deberían tener experiencia en el reconocimiento y visualización de estructuras cardíacas. Además, no se pueden realizar mediciones de presión directamente y los cálculos se obtienen a partir de la combinación de magnitudes de tamaño y mediciones de flujo. Por otro lado, tiene la ventaja de que se pueden realizar varias mediciones en el mismo animal y la función cardíaca se puede monitorear, por ejemplo, durante la progresión de la enfermedad. En cuanto a la medición de volumen, la resonancia magnética es el procedimiento estándar de oro, pero similar a la ecocardiografía, no es posible realizar mediciones de presión directa y solo se pueden obtener parámetros dependientes de la precarga8. Los factores limitantes son también la disponibilidad, el esfuerzo de análisis y los costos operativos. Aquí los métodos basados en catéteres para medir la función cardíaca son una buena alternativa que además permiten el monitoreo directo de la presión intracardíaca y la determinación de parámetros de contractilidad independientes de la carga, como el trabajo de accidente cerebrovascular reclutable precarga (PRSW)9. Sin embargo, los volúmenes ventriculares medidos por un catéter de conductancia de presión (mediante determinación de conductividad) son menores que los de la resonancia magnética, pero las diferencias de grupo se mantienen en el mismo rango10. Para determinar valores de volumen confiables, se requiere la calibración correspondiente, que es un paso crítico durante las mediciones de PVL. Combina mediciones ex vivo de la conductividad sanguínea en cubetas calibradas por volumen (conversión de conductancia a volumen) con el análisis in vivo para la conductancia paralela del miocardio durante la inyección en bolo de la solución salina hipertónica11,12. Más allá de eso, el posicionamiento del catéter dentro del ventrículo y la orientación correcta de los electrodos a lo largo del eje longitudinal del ventrículo son críticos para la capacidad de detección del campo eléctrico circundante producido por ellos. Aún con el tamaño reducido del corazón de ratón es posible evitar artefactos producidos por cambios en la orientación intraventricular del catéter, incluso en ventrículos dilatados5,10,pero los artefactos pueden evolucionar bajo estimulación β-adrenérgica6,13. Además de los métodos de conductancia, el desarrollo del método basado en la admisión parecía evitar los pasos de calibración, pero aquí los valores de volumen están bastante sobreestimados14,15.
Dado que el ratón es uno de los modelos preclínicos más importantes en la investigación cardiovascular y la reserva β-adrenérgica del corazón es de interés central en la fisiología y patología cardíaca, aquí presentamos un protocolo refinado para determinar la función cardíaca in vivo en ratones mediante mediciones de PVL durante la estimulación β-adrenérgica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, proporcionamos un protocolo para analizar la función cardíaca in vivo en ratones bajo estimulación β-adrenérgica creciente. El procedimiento se puede utilizar para abordar tanto los parámetros basales de la función cardíaca como la reserva adrenérgica (por ejemplo, inotropía y cronotropía) en ratones modificados genéticamente o en intervenciones. La ventaja más destacada de las mediciones de bucle de presión-volumen (PVL) en comparación con otros medios para determinar la función cardíaca es el an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter y al equipo de la Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) de la Universidad de Heidelberg por la asistencia técnica experta.
Este trabajo fue apoyado por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), el BMBF (Ministerio Alemán de Educación e Investigación), un fondo de innovación del estado federal de Baden-Württemberg y el Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) Project-ID 239283807 – TRR 152, FOR 2289 y el Centro de Investigación Colaborativa (SFB) 1118.
Materials
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
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