Summary
우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.
Abstract
Metabolomics는 세포 내의 많은 저분자 중량 중간체 및 물질 대사의 제품을 식별 및 정량화하는 데 사용되는 방법론입니다. 메타볼로믹스는 전통적으로 수용성 대사산물에 초점을 맞추고 있습니다. 수용성 메타볼로메는 다양한 게놈, 전형, 전사, 프로테오믹 및 환경 요인을 통합하는 복잡한 세포 네트워크의 최종 제품입니다. 따라서, metabolomic 분석은 각종 유기체 내의 생물학 프로세스의 과다에서 이 모든 요인에 대한 행동의 결과를 직접 평가합니다. 이러한 유기체 중 하나는 완전히 서열게놈을 가진 단세포 진핵생물인 신진 효모 사카로미세스 세레비시아입니다. S. cerevisiae는 포괄적인 분자 분석에 순종하기 때문에, 진핵 세포 내의 많은 생물학적 프로세스의 근본적인 기계장치를 해부하기위한 모델로 사용됩니다. 수용성 메타볼로메의 견고하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법은 이러한 메커니즘을 해부하는 데 필수적인 방법론을 제공할 것입니다. 여기서 우리는 S. 세레비시아 세포로부터 담금질및 수용성 대사산물 추출의 최적화된 조건에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 추출된 수용성 대사산물의 정량적 분석을 위해 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 이러한 대사 산물의 다른 구조 이성질체 및 스테레오시컬 형태를 포함하여 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 갖춘 370개 이상의 수용성 대사산물을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 이 대사 산물은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체를 포함합니다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 민감하며 0.05 pmol/μL의 농도에서 일부 수용성 대사산물의 식별 및 양을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 다른 조건에서 배양된 야생형 및 돌연변이 효모 세포의 수용성 메타볼로메를 평가하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
Introduction
수용성 대사 산물은 저분자-분자량 중간체및 필수 세포 과정에 기여하는 신진 대사의 제품입니다. 이러한 진화적으로 보존된 과정에는 영양분을 사용 가능한 에너지로 변환하는 것, 거대 분자의 합성, 세포 성장 및 신호, 세포 주기 제어, 유전자 발현 조절, 스트레스 반응, 대사 후 조절, 미토콘드리아 기능 유지, 혈관 세포 인신 매매, 자가 세포 노화 및 규제 된 세포 죽음1,2,3.
수용성 대사산물의 이러한 필수 역할중 상당수는 신진 효모 S. 세레비시아1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21, 22의연구에 의해 발견되었다. 이러한 단세포 진핵생물은 수용성 대사산물이 고급 생화학, 유전적 및 분자 생물학적 분석23,24,25,26에대한 복종성으로 인한 세포 과정에 기여하는 메커니즘을 해부하는 데 유용한 모델 유기체이다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 신진 효모3,18,22,27에서수용성 대사산물의 역할을 연구하는 데 사용되었지만, 이러한 유형의 분석은 다재다능성, 견고성, 감도 및 이러한 대사산물의 스테레오릭 형태를 구별하는 능력의 개선이 필요합니다.
최근 몇 년 동안 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법을 생체내 용해성 대사산물 프로파일링에 적용하는 데 상당한 진전이 있습니다. 그러나, 이 방법론을 사용하는 많은 도전은2,28,29,30,31,32,33,34, 35,36남아있다. 이러한 과제에는 다음이 포함됩니다. 첫째, 많은 수용성 대사산물의 세포 내 농도는 현재 사용되는 방법에 대한 감도의 임계값 미만이다. 둘째, 대사 활성 담금질의 효율이 너무 낮고, 세포 내 대사산물의 담금질 관련 세포 누설의 정도는 현재의 방법에 대해 너무 높다; 따라서, 현재 사용되는 방법은 수용성 대사 산물의 세포 내 농도를 과소 평가한다. 셋째, 기존 방법은 구조이소(즉, 동일한 화학 적 분수하지만 다른 원자 연결을 가진 분자) 또는 스테레오이머스(즉, 동일한 화학 공식 및 원자 연결을 가진 분자,하지만 우주에서 다른 원자 배열)를 특정 대사 산물의 분화할 수 없다; 이것은 현재 사용된 방법에 의하여 특정 대사 산물의 정확한 표시를 방지합니다. 넷째, 모시 이온(MS1) 및 이차 이온(MS2)의 기존 질량 스펙트럼 온라인 데이터베이스는 불완전하다; 이는 현재 방법의 도움으로 생성된 원시 LC-MS/MS 데이터를 사용하여 특정 대사산물의 정확한 식별 및 수량에 영향을 미칩니다. 다섯째, 기존 방법은 단일 유형의 대사산물 추출을 사용하여 수용성 대사산물의 전부 또는 대부분의 클래스를 복구할 수 없습니다. 여섯째, 기존 메서드는 LC 컬럼의 단일 유형을 사용하여 수용성 대사산물의 전부 또는 대부분의 클래스와 분리할 수 없습니다.
여기에서, 우리는 S. cerevisiae 세포 내의 신진 대사 활동의 담금질을 위한 조건을, 추출하기 전에 이 세포 내의 수용성 대사산물의 대부분을 유지하고, 효모 세포에서 수용성 대사산물의 대부분의 클래스를 추출하기 위한 조건을 조정했습니다. 우리는 S. cerevisiae 세포에서 추출한 370개 이상의 수용성 대사산물의 LC-MS/MS 기반 식별 및 정량화를 위한 다재다능하고 견고하며 민감한 방법을 개발했습니다. 비표적 메타볼로믹스의 이 방법은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체의 세포내 농도를 평가할 수 있게 한다. 개발된 LC-MS/MS 방법은 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 가진 다양한 구조 이성질체 및 입체형 형태의 수용성 대사산물의 식별 및 정량화를 허용합니다.
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Protocol
1. 효모 성장을 위한 배지 만들기 및 살균
- 180mL의 완전한 효모 추출물을 박테리아펩톤(YP) 배지로 만듭니다. 완전한 YP 배지에는 효모 추출물 1%(w/v) 및 2%(w/v) 바토펩톤이 포함되어 있습니다.
- YP 배지 180mL를 250mL 에렌마이어 플라스크 4개에 동등하게 분배한다. 이러한 플라스크 각각에는 YP 배지의 45mL가 포함되어 있습니다.
- 15 psi/121°C에서 45분 동안 자동화하여 YP 배지로 플라스크를 살균합니다.
2. 야생 형 효모 균주
- BY4742(MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)스트레인을 사용한다.
3. 2%의 포도당을 함유하는 YP 배지에서 효모 증가
- 포도당의 20% (w/v) 스톡 용액을 15 psi/121°C에서 45분 동안 자동화하여 살균합니다.
- 멸균 된 YP 배지의 45 mL로 두 Erlenmeyer 플라스크 각각에 포도당의 20 % (w /v) 스톡 용액의 5 mL을 추가합니다. YP 배지의 최종 농도 포도당은 2%(w/v)이다.
- 2% 포도당을 포함하는 YP 배지를 가진 2개의 Erlenmeyer 플라스크의 각각으로 효모 세포를 접종하는 미생물 루프를 사용합니다.
- 효모 세포를 200 rpm에 설정된 회전 셰이커에서 30°C에서 하룻밤 동안 성장시다.
- 효모 문화의 알리쿼트를 가져 가라. 배양mL당 효모 세포의 총 수를 결정합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.
4. 세포 전달 및 세포는 2% 포도당으로 YP 배지에서 성장합니다
- 멸균된 20% (w/v) 스톡 용액의 5mL를 나머지 2개의 Erlenmeyer 플라스크에 오토클레이브 YP 배지로 추가합니다. 포도당의 최종 농도는 2% (w/v)입니다.
- YP 배지에서 야간 효모 배양의 부피를 2%의 포도당을 포함하는 YP 배지로 각각 5.0 x 107 세포의 총 수를 포함하는 2%의 포도당을 전송한다. 세포 전달을 위해 멸균 파이펫을 사용합니다.
- 200 rpm에서 설정된 회전 셰이커에서 30°C에서 적어도 24h(또는 실험이 요구하는 경우) 효모 세포를 성장시한다.
5. 시약 만들기, 실험실 준비, 세포 담금질 장비 설정
- 다음 준비: 1) 담금질 용액 (60% 고급 (>99.9%) 메탄올 155 mM 암모늄 중탄산염 (ABC) 버퍼, pH = 8.0); 2) 얼음 차가운 ABC 솔루션 (pH = 8.0); 3) -20 °C까지 측정 할 수있는 디지털 온도계; 4) 500 mL 큰 원심 분리기 병; 5) 사전 냉각 된 로터와 사전 냉각 된 500 mL 원심 분리기 병이있는 사전 냉각 된 고속 원심 분리기는 -5 °C에서 모두; 6) 대사 산물 추출 튜브 (폴리테트라플루오로에틸렌 안감 캡15 mL 고속 유리 원심분리기 튜브); 및 7) 드라이 아이스.
6. 세포 담금질
- 혈류계를 사용하여 YP의 mL 당 효모 세포의 수를 2% 포도당 배양시로 결정합니다.
- YP 배지에서 배양물의 양을 2%의 포도당을 전달하여 총 5.0 x 108 세포의 총 수를 사전 냉각된 500mL 원심분리기 병으로 이송한다.
- -20°C에 저장된 담금질 용액으로 세포를 200mL의 부피까지 포함하는 원심분리기 병을 신속하게 채웁니다.
- -5°C에서 3분 동안 11,325 x g의 고속 원심분리기에서 병을 원심분리합니다.
- 원심분리기에서 병을 빠르고 부드럽게 복구합니다. 뚜껑을 부드럽게 풀고 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다.
- 10mL의 얼음 차가운 ABC 버퍼로 셀 펠릿을 신속하게 회수하고 현탁액을 대사 산물 추출을 위한 폴리테트라플루오로틸렌 안감 캡이 있는 15mL 고속 유리 원심분리기 튜브로 이송합니다.
- 0°C에서 3분 동안 3,000 x g에서 임상 원심분리기에서 원심분리기로 세포를 수집합니다.
- 상체를 신속하게 제거하고 튜브를 드라이 아이스에 배치하여 대사산물 추출을 시작하거나 추출할 때까지 -80°C에 튜브를 저장합니다.
7. 대사 산물 추출시 시약, 실험실 용품 및 장비 준비
- 다음 준비: 1) LC-MS 등급 클로로폼; 2) LC-MS 등급 메탄올; 3) LC 등급 나노 순수 한 물; 4) LC-MS 등급 (ACN); 5) 유리 구슬 (산 세척, 425-600 μm); 6) 리테이너가있는 폼 튜브 홀더 키트가있는 소용돌이; 7) 폴리테트라플루오로틸렌 안감 캡이 있는 15mL 고속 유리 원심분리기 튜브; 8) MS 바이알; 9) 드라이 아이스; 및 10) 1.5 mL 튜브는 에탄올로 한 번 세척, ACN과 한 번 나노 순수 한 물로.
참고: 유기 용매에 강한 폴리프로필렌으로 만든 마이크로피펫 팁과 튜브만 사용하십시오.
8. 대사 산물 추출
- 건조 얼음에 보관하거나 6.7단계에서 -80°C 튜브에 저장된 대사산물에, 다음을 추가하였다: 1) 2mL의 클로로포형은 -20°C에 저장된다; 2) -20 °C에 저장된 메탄올 1 mL; 3) 얼음 차가운 나노 순수 한 물의 1 mL; 및 4) 425-600 μm산 세척 유리 구슬의 200 μL.
- 알루미늄 호일로 튜브의 입을 덮고 닫습니다. 튜브를 리테이너와 함께 폼 튜브 홀더 키트에 놓고 중간 속도(즉, 6에서 설정된 속도) 4°C에서 30분 동안 튜브를 소용돌이로 처리하여 대사산물 추출을 용이하게 합니다.
- 튜브를 얼음에 15분 동안 배양하여 단백질 강수량과 하부 유기상으로부터 수성의 분리를 촉진합니다.
- 4°C에서 10분 동안 3,000 x g의 임상 원심분리기에서 튜브를 원심분리합니다. 이 원심 분리 단계는 중간 층 (세포 파편과 단백질을 포함하는) 및 낮은 유기 상 (주로 지질을 포함하는)에서 상부 수성 단계 (수용성 대사 산물을 포함하는)를 분리 할 수 있습니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 상부 수성 상(400 μL)을 -20°C에 저장된 ACN의 800μL을 포함하는 세척 및 표지된 1.5mL 튜브로 전송한다.
참고: ACN에 상부 수성 위상을 추가한 후 백색 구름 침전이 있을 것입니다.-20°C. - 4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 탁상 원심분리기에서 샘플로 튜브를 원심분리합니다.
참고: 원심 분리 후 흰색 구름 침전이 사라집니다. - 튜브내 액체의 상부에서 800 μL을 표지된 MS 바이알로 옮기다. LC-MS/MS에 의해 분석될 때까지 샘플을 0°C로 저장합니다.
9. LC용 시약, 실험실 및 장비 준비
- 다음 준비: 1) 소용돌이; 2) 초음파 초음파 처리기; 3) MS 유리 유리 바이알; 4) 이진 펌프, 드가저 및 자동 샘플러가 장착 된 LC 시스템; 5) 재료표에명명된 zwitterionic 상 크로마토그래피 컬럼(5μm 폴리머, 150 x 2.1 mm); 6) 컬럼 히터; 및 7) 20mM암모늄 아세테이트, pH = 8.0 및 위상 B(100% ACN)를 포함하는 상 A(5:95 ACN:water(v/v)를 포함하는 이동상.
10. LC에 의해 추출된 대사산물의 분리
- MS 바이알의 함량을 초음파 초음파로 15 분 동안 피사체.
- 실온(RT)에서 10초 동안 MS 바이알 3x를 소용돌이시다.
- MS 바이알을 웰 플레이트에 넣습니다.
- 크로마토그래프 동안, 기둥을 45°C및 0.250mL/min의 유량으로 유지한다. 샘플을 웰 플레이트에 0°C로 유지합니다. 크로마토그래피 중에 사용해야 하는 LC 그라데이션의 표 1을 참조하십시오.
참고: 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출된 수용성 대사산물의 대표적인 총 이온 크로마토그램이 도 1에도시된다. LC에 의해 분리된 대사산물은 11단계에 대해 설명된 바와 같이 양성 이온화[ESI(+)] 모드에서 수행된 질량 분광 분석에 의해 확인및 정량화되었다.
11. LC에 의해 분리된 대사 산물의 질량 분광 분석
- LC에 의해 분리된 수용성 대사산물의 식별 및 수량을 위해 가열된 전기분무(HESI)가 장착된 질량 분광계를 사용합니다. MS1 이온에 대한 질량 분광계의 분석기와 MS2 이온에 대한 질량 분광계의 검출기를 사용합니다. 각각 MS1 및 MS2 이온의 데이터 종속 수집에 대해 표 2 및 표 3에 제공된 설정을 사용합니다.
- ESI(+) 및 ESI(-) 모드에서 모두 주입에 10 μL의 샘플 부피를 사용합니다.
12. LC-MS/MS의 원시 데이터 처리에 의한 다른 대사 산물의 식별 및 수량
- 재료의 표에 명명 된 소프트웨어를 사용하여 원시 LC-MS / MS 파일에서 다른 수용성 대사 산물의 식별 및 수량을 수행합니다. 이 소프트웨어는 대사 산물 수량에 대한 MS1을 사용하고 대사 산물 식별을 위해 MS2를 사용합니다. 이 소프트웨어는 MS 스펙트럼을 일치시켜 LC-MS/MS 원시 데이터를 사용하여 대사 산물에 주석을 지정하기 위해 가장 광범위하게 선별된 질량 스펙트럼 조각 라이브러리를 활용합니다. 이 소프트웨어는 또한 MS1및 동위원소 패턴의 정확한 질량을 온라인 데이터베이스를 사용하여 대사 산물에 대한 부토에 일치합니다. 자세한 내용은 그림 2를 참조하십시오.
- 온라인(https://www.mzcloud.org)에서 자유롭게 사용할 수 있는 데이터베이스 및 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 원시 데이터의 MS2 스펙트럼을 검색합니다.
13. 프로피듐 이오드 (PI) 염색 및 형광 현미경 검사에 의한 멤브레인 무결성 분석
- 6단계에 대해 설명된 바와 같이 수행된 세포 담금질 후, 담금질 용액을 제거하기 위해 15mL의 ABC 버퍼로 담금질 세포를 철저히 세척한다. 0°C에서 5분 동안 3,000 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.
- ABC 버퍼의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 PI 용액의 0.5 mL을 추가합니다(0.5 mg/mL).
- 10s에 대한 샘플 3x와 튜브를 소용돌이와 어둠과 얼음에 10 분 동안 배양.
- 4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 탁상 원심분리기에서 샘플로 튜브를 원심분리합니다.
- 상체를 제거하고 ABC 버퍼의 1 mL에서 펠릿을 다시 분리합니다.
- 4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 튜브원심분리기를 제거하고 상류체를 제거합니다. 이 단계를 2회 더 반복하여 셀 표면에 바인딩된 PI를 제거합니다.
- ABC 버퍼의 300 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 현미경 슬라이드의 표면에 서스펜션의 10 μL을 놓습니다.
- 형광 현미경으로 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 및 형광 현미경 이미지를 캡처합니다. 593nm 및 636nm(각각)의 여기 및 방출 파장에 설정된 필터를 사용합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 총 세포 수(DIC 모드에서)와 형광 염색 된 세포의 수를 계산합니다. 또한 이 소프트웨어를 사용하여 개별 셀에 대한 염색 강도를 결정합니다.
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Representative Results
효모 세포 내의 수용성 대사산물의 정량적 평가를 개선하기 위해 대사 산물 검출을 위한 세포 담금질 조건을 최적화했습니다. 이러한 목적을 위해 세포 담금질은세포31,33,37,38내의 모든 효소 반응의 신속한 체포를 포함한다. 이러한 세포대사 활성의 이러한 체포는 생체 내에서 수용성 대사산물의 양을 양화하는 방법의 필수적인 단계로서 세포내 농도31,33,37,38의과소 평가를 방지하기 때문이다. 대사 산물 평가를 위한 세포 담금질은 항상 플라즈마 막 (PM)의 무결성을 손상시킵니다 (및 세포벽의 (CW), 존재하는 경우); 이로 인해 세포로부터 대사산물 누출이발생31,33,37,38. 이 방법은 이러한 손상을 최소화하는 세포 담금질 조건을 사용하여 세포 내 대사 산물의 담금질 관련 세포 누출을 현저히 감소시합니다. 실제로, 세포 담금질에 대한 대부분의 현재 방법은 특정 온도 (즉, -20 °C, -40 °C, 또는 -60 °C), 또는 -60 °C, 또는 -60 °C, 또는 -60 °C, 또는 -60 °C, 또는 -60 °C, 또는 31, 버퍼 없이31, 31의메탄올(즉, 40 % (v /v), 60 % (v / v), 80 % (v / v) 또는 100 % (v /v))의 사용을포함한다. 현재 사용되는 세포 담금질 방법 중 하나에 대한 PM 및 CW 손상의 효율을 비교했습니다(즉, 상기완충제(38)의부재시 -40°C에서 -40%(v/v) 메탄올을 이용한 세포 처리에 의하여 변형된 세포 담금질 방법(즉, 세포 처리에 의하여 60%(v/v) 메탄올을 -20°C로 처리하여 pH=8=8=8=8=8=8=8.0)에서 ABC의 이소톤 버퍼용액이 존재한다는 것이다. PI는 그대로 세포에 침투할 수 없는 형광염료; PM(및 CW의 무결성이 있는 경우)이39가손상된 경우에만 셀에 들어갈 수 있다. 더욱이, PI에 의한 형광 방출의 강도는 DNA 또는RNA(39)에묶여 있을 때 30배 상승한다. 따라서, PI 염색 분석체는 효모 세포의 PM 및 CW가손상된경우에만 세포내 대사산물이 세포외 공간으로 누출될 수 있기 때문에 세포내 대사산물의 담금질 관련 세포 누설의 효율을 평가하는 데 사용될 수 있다. 상기 변형된 세포 담금질 방법은 -40°C(도3)에서비완충된 80%(v/v) 메탄올을 이용한 세포 처리에 의한 담금질 방법보다 PM 및 CW에 현저히 낮은 손상을 일으킨다는 것을 발견했다. 실제로, 거의 모든 세포가 적색 형광 방출을 나타내는 방법을 사용하여 담금질을 실시하였고, 이는 PM과 CW가 손상되지 않은 효모 세포의 특징이다(도3). 대조적으로, 거의 모든 세포는 다른 방법을 사용하여 담금질을 실시하였고, PM과 CW가 현저히 손상된 효모 세포의 녹색 형광 방출 특성을나타냈다(도 3). 가장 강렬한 적색 형광은 강력한 적색 형광과 온화한 적색 형광 방출을 구별하기 위해 소프트웨어에 의해 녹색 형광으로 변환되었습니다.
상기 변형된 세포 담금질 방법은 효모 세포로부터 의 수용성 대사산물의 유의하를 -40°C에서 80%(v/v) 메탄올로 세포 처리에 의한 담금질 방법. 우리는 pH = 8.0에서 ABC의 동소완충액의 존재에서 -20°C에서 -20%(v/v) 메탄올을 이용한 세포 처리방법(즉, 세포 처리에 의하여) 담금질하는 효모 세포의 동일한 수를 실시; 도 4) 또는 다른 방법(즉, -40°C에서 비완충80%(v/v) 메탄올을 이용한 세포 처리에 의해; 그림 5). 세포 외 용액으로 담금질 관련 세포 누설의 정도는 LC-MS/MS의 도움으로 특정 수용성 대사 산물에 대해 평가되었다. 세포 외 용액에서 다른 아미노산 클래스 (즉, 크고 작은 산성, 기본, 중성 성극성 및 중성 극성 아미노산)의 농도는 세포 담금질 전후에 측정되었다. 우리는 세포 담금질 방법이 다른 방법(도 5)보다세포 외 용액(도 4)으로이러한 모든 아미노산 클래스의 현저하게 낮은 누설을 일으키는 것으로 나타났습니다.
효모 세포 내의 수용성 대사산물의 정량적 평가를 위한 LC-MS/MS 방법은 모든 수용성 대사산물 클래스의 크로마토그래피 분리를 위해 단일 유형의 컬럼을 사용합니다. 이 열은 재료 표에 명명된 zwitterionic 상 열입니다. 이 열은 재료표(보충 표 1)에명명된 역상 열보다 다양한 종류의 수용성 대사산물을 훨씬 효율적으로 분리하는 것을 발견했습니다. 실제로, 수온성 대사산물 표준(즉, NAD+, AMP, GMP, 아르기닌 및 글루타믹산)의 고정 시간(RT) 시프트 값은 현저히 낮았으며, 정류형 상 열에 대해 피크 형상이 현저히 날카로워졌으며, 역상열(보충표 1)과비교하면, 역상 열에 대한 모든 대사 산물(즉, 수용성 및 수용성)의 크로마토그래피 분리에 사용되는 LC 조건은 보충표 2에제공된다.
LC-MS/MS 방법의 또 다른 장점은 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 가진 서로 다른 수용성 대사산물과 효율적으로 분리하기 위해 위의 zwitterionic 상 열에 크로마토그래피 분리 의 능력에 있습니다. 이러한 수용성 대사산물은 다음과 같은 대사산물 클래스를 포함한다: 1) 산성, 기본, 중성 극성 및 비중성 극성 아미노산, 그들의 다른 구조 이소마를 포함(도 6); 2) 세포 내에서 중요한 기능을 수행하는 안정적이고 불안정한 뉴클레오티드 및 그 파생(도 7); 및 3) 다양한 단색차라이드, 그들의 다른 입체 형태를 포함(도 8).
중요한 것은 효모 셀 내의 수용성 대사산물의 정량적 평가를 위한 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고했다는 것입니다. S. 세리비세이아세포에서 2%의 포도당을 함유하고 있는 S. 세레비시아세포에서 다양한 구조적, 물리적, 화학적 특성을 가진 374개의 수용성 대사산물을 식별하고 정량화할 수 있었습니다(보충표3). 240대사산물은 양성 이온화 모드에서 검출되었고 134개의 대사산물은 음의 이온화 모드에서 검출되었다. 이러한 모든 수용성 대사산물의 ID는 양수 및 음수 이온화 모드에서 모두 획득한 데이터 의존적 수집(DDA) MS2 조각을 MS2 mzCloud 스펙트럼 라이브러리에 일치시킴으로써 확인되었습니다. 이 온라인 라이브러리에는 MS1 및 DDA MS2 매개 변수와 다른 대사 산물 표준의 스펙트럼이 포함됩니다. 샘플의 MS2 스펙트럼과 온라인 스펙트럼 라이브러리와 일치하는 정도를 최대화하기 위해 다양한 DDA MS2 매개 변수를 사용했습니다. 이러한 매개 변수는 보충 표 4에제공됩니다. 동일한 시료에 대한 거의 6,000개의 특징(putative bolabolites)은 상위 5개의 MS2 이벤트, 35개의 충돌 에너지 값 및 10ms 활성화 시간을 사용하여 고에너지 유도 충돌-해리(HCD) 또는 충돌 유도 해리(CID) 단편화 방법의 도움으로 획득되었다. 결과 파일을 > 95% MS2 매칭 및 > 90% MS1 동위원소 패턴 매칭 기준으로 필터링한 후 HCD 단편화된 조건하에서 162개의 대사산물과 CID 단편화된 조건하에서 142개의 대사산물만 확인되었다. 162개의 대사산물 중 81개가 HCD 단편화 방법에 고유한 반면, 142명 중 42명은 CID 단편화 방법에 고유하였다(보충표 4에서"T5_35E__10 ms_HCD 대 CID"라는 시트 참조). 따라서 LC-MS/MS 방법의 도움으로 수용성 대사산물의 올바른 음표가 많은 다른 DDA MS2 파라미터의 사용을 필요로 한다는 결론을 내렸습니다.
LC-MS/MS 방법도 매우 민감합니다. 0.05 pmol/μL의 농도에서 일부 수용성 대사산물을 식별하고 양수할 수 있습니다(표 4의페닐알라닌에 대한 데이터 참조). 이러한 수량 제한은 다른 대사산물클래스(표 4)에대한 광범위한 농도 범위 내에서 다릅니다.
여기서 사용되는 MS 시스템은 다양한 대사 산물의 농도를 측정하기 위한 넓은(최소 2배 의 크기) 선형 동적 범위를 가지고있다(보충 표 5).
도 1: 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출된 수용성 대사산물의 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC-MS) 데이터로부터의 총 이온 크로마토그램(TIC). 대사 산물은 재료의 표에명명 된 zwitterionic 단계 크로마토그래피 컬럼에 LC에 의해 분리되었다. 대사 산물은 양극전기분사 이온화 모드를 사용하여 생성된 모이온(MS1)의 MS에 의해 검출되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 재료표에 명명된 소프트웨어의 도움으로 수용성 대사산물 을 분석하는 데 사용되는 워크플로. 모든 매개 변수는 다음을 제외하고 MS 원시 데이터를 기반으로 소프트웨어에 의해 자동 보정되었습니다: 1) "화합물 탐지" 탭: 설정 분, 피크 강도 10,000; 및 2) "검색 ChemSpider" 탭: 바이오사이클, 인간 메타볼로메 데이터베이스, KEGG 및 효모 메타볼로메 데이터베이스를 포함한 대사 산물의 식별을 위해 4개의 온라인 데이터베이스가 선택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 차동 간섭 대비(DIC; 상단 행) 및 형광(아래줄) 효모 세포의 현미경 이미지는 암모늄 중탄산염(ABC) 버퍼(pH = 8.0; 제어)로 담금질하거나 다른 담금질 용액으로 담금질하였다. 세포 담금질 후, 동일한 수의 세포가 어둠과 얼음에서 10 분 동안 PI 용액으로 배양되었습니다. 가장 강렬한 적색 형광은 강력한 적색 형광과 온화한 적색 형광 방출을 구별하기 위해 소프트웨어에 의해 녹색 형광으로 변환되었습니다. PM 및 CW에 손상의 효율은 세포 담금질 의 방법에 대해 비교되었다 (즉, 세포 처리에 의해 -20%(v/v) 메탄올 -20°C에서 -20°C로 현재 사용되는 방법 중 하나인 IH=8.0) 및 현재 사용되는 방법 중 하나(즉, 완충이 없는 경우 -40°C에서 -40%(v/v) 메탄올을 사용한 세포 처리에 의해). 축척 막대가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 세포 담금질 방법에 대한 상이한 아미노산 클래스의 누설 비율. 효모 세포의 5.0 x 108은 pH = 8.0에서 ABC의 동소닉 버퍼링 용액이 있는 동안 -20°C에서 60%(v/v) 메탄올로 처리하여 담금질을 실시하였다. 다른 아미노산 클래스의 누설 비율은 LC-MS/MS를 사용하여 담금질 전후의 세포 외 용액에서의 농도를 측정한 것으로 평가되었습니다. SD 및 개별 데이터 요소가 ± 평균 값이 표시됩니다(n = 3). * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 현재 사용되는 세포 담금질 방법 중 하나에 대해 상이한 아미노산 클래스의 누설 비율. 효모 세포의 5.0 x 108은 완충제가 없는 경우 -40°C에서 80%(v/v) 메탄올을 가진 처리에 의해 담금질하도록 하였다. 다른 아미노산 클래스의 누설 비율은 LC-MS/MS를 사용하여 담금질 전후의 세포 외 용액에서의 농도를 측정한 것으로 평가되었습니다. SD 및 개별 데이터 요소가 ± 평균 값이 표시됩니다(n = 3). * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 재료표에 명명된 zwitterionic 상 열상에 산성, 기본, 중성 극성 및 비중성 극성 아미노산 클래스의 효율적인 크로마토그래피 분리. 이러한 모든 아미노산은 양성 이온화 [ESI(+) 모드에서 MS/MS에 의해 검출되었다. zwitterionic 상 크로마토그래피 컬럼에 대한 LC조건은 표 1에설명되어 있다. MS/MS에 대한 조건은 표 2 및 표 3에설명되어 있습니다. 모든 아미노산 표준은 상업적으로 구입됩니다 (예 : 시그마). 3개의 독립적인 크로마토그래피 실행 사이의 보존 시간 이동은 ± 10초 미만입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 유동적으로 불안정한 뉴클레오티드(뉴클레오사이드 단인산염, 뉴클레오시드 디포스페이트, 뉴클레오시드 트리포산염) 및 전자 담체 분자(NADH 및 NAD+)를 포함한 다양한 종류의 뉴클레오티드 클래스의 효율적인 크로마토그래피 분리가재료의 표에 명명된 zwitterionic-phase 컬럼에 있습니다. 이러한 모든 뉴클레오티드는 양성 이온화[ESI(+)] 모드에서 MS/MS에 의해 검출되었다. zwitterionic 상 크로마토그래피 컬럼에 대한 LC조건은 표 1에설명되어 있다. MS/MS에 대한 조건은 표 2 및 표 3에설명되어 있습니다. 모든 뉴클레오티드 표준은 상업적으로 구입됩니다(예를 들어, 시그마). 3개의 독립적인 크로마토그래피 실행 사이의 보존 시간 이동은 ± 10초 미만입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 구조 이소머와 알도- 케토헥소스(과당, 만노, 갈락토스) 및 알드펜토스(리보스 와 아라비노스)의 구조적 이소머와 스테레오릭 형태를 포함한 다양한 종류의 모노사카라이드 클래스의 효율적인 크로마토그래피 분리가재료의 표에 명명된 zwitterionic-phase 컬럼에 있습니다. 이러한 모든 단당류는 양성 이온화 [ESI(+)] 모드에서 MS/MS에 의해 검출되었다. zwitterionic 상 크로마토그래피 컬럼에 대한 LC조건은 표 1에설명되어 있다. MS/MS에 대한 조건은 표 2 및 표 3에설명되어 있습니다. 모든 모노사카라이드 표준은 상업적으로 구입됩니다(예: 시그마). 3개의 독립적인 크로마토그래피 실행 사이의 보존 시간 이동은 ± 10초 미만입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 열 유형 | 세콴트 ZIC-pHILIC 5μm 폴리머 150 x 2.1 mm | ||
| 용매 A | LC-MS 등급 H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM 암모늄 아세테이트 | ||
| 용매 B | LC-MS 급 아세토닐릴 (ACN) | ||
| 압력 제한 | 최대 = 300 바 | 최소 = 0 | |
| HPLC 그라데이션 프로그램 | |||
| 시간(분) | 유량(0.25 ml/분) | 작곡 | |
| A% | B% | ||
| 0.5 | 0.25 | 5 | 95 |
| 26 | 0.25 | 40 | 60 |
| 30 | 0.25 | 70 | 30 |
| 31 | 0.25 | 70 | 30 |
| 31.1 | 0.4 | 5 | 95 |
| 43.9 | 0.4 | 5 | 95 |
| 44 | 0.25 | 5 | 95 |
| 45 | 0.25 | 5 | 95 |
표 1: LC 조건은 재료표에 명명된 zwitterionic 상 열의 도움으로 수용성 대사산물의 분리에 사용됩니다. 이러한 조건은 여기에 설명된 모든 실험에서 사용되었습니다.
| 전체 스캔 질량 범위(달튼) | 70-900 |
| FTMS (궤도 랩 분석기) 전체 스캔 해상도 | 6.0 x 104 |
| FTMS (궤도 랩 분석기) HCD 해상도 | 7500 |
| FTMS 전체 스캔 AGC 대상 | 1.0 x 106 |
| FTMS MSn AGC 타겟 | 5.0 x 104 |
| 이온 트랩 (LTQ) MSn AGC 대상 | 1.0 x 104 |
| 이온 소스 유형 | 가열 된 전기 분무 이온화 |
| 모세관 온도 (°C) | 275 |
| 소스 히터 온도(°C) | 250 |
| 시스 가스 흐름 | 10 |
| 오가스 흐름 | 5 |
표 2: LC에 의해 분리된 대사산물을 분석하는 데 사용되는 질량 분광계 설정입니다. 이러한 조건은 여기에 설명된 모든 실험에서 대사 산물의 분석을 위해 사용되었다. 약어: FTMS = 푸리에 변환 (FTMS); HCD = 고에너지 유도 충돌-해리; LTQ = 선형 트랩 쿼드러폴; AGC = 자동 게인 제어, MS 및 MS/MS에 대한 이온 모집단 값입니다.
| 악기 극성 | 양수/음수 |
| 활성화 유형 | CID/HCD |
| 최소 신호 필요 | 5000 |
| 격리 폭 | 2 |
| CID에 대한 정규화 된 충돌 에너지 | 35, 60 |
| HCD에 대한 정규화 된 충돌 에너지 | 35, 45, 55 |
| 기본 충전 상태 | 1 |
| CID활성화 시간(ms) | 10, 30 |
| HCD(ms)의 활성화 시간 | 10 |
| CID의 MS/MS 이벤트 수 | 탑 3, 상위 5위, 상위 10위 |
| HCD의 MS/MS 이벤트 수 | 상위 5위 |
| HCD 및 CID 모두에 사용되는 마이크로 스캔 수 | 1 |
표 3: 이차 이온(MS2)을 감지하는 데 사용되는 질량 분광계 설정입니다. 약어: HCD = 고에너지 유도 충돌-해리; CID = 충돌 유도 해리; MS = 밀리초.
| 성 대사 산물 | M.W. (g/두더지) | [M+H]+1 | [M-H]-1 | 감지 모드 | 검출된 최적 농도(pmol/μL) |
| 글리신 | 75.03203 | 76.03931 | 74.02475 | P | 7.43E+00 |
| 트립토판 | 204.08988 | 205.09716 | 203.0826 | P | 5.56E-02 |
| 페닐알라닌 | 165.07898 | 166.08626 | 164.0717 | P | 5.14E-02 |
| 아르기닌 | 174.11168 | 175.11896 | 173.1044 | P | 7.14E-02 |
| 스레오닌* | 119.05824 | 120.06552 | 118.05096 | P | |
| 세린 () | 105.04259 | 106.04987 | 104.03531 | P | 4.66E+00 |
| 조미료 | 147.05316 | 148.06044 | 146.04588 | P | 4.20E-01 |
| 메티오닌 | 149.05105 | 150.05833 | 148.04377 | P | 1.96E+00 |
| 아스파르타트 | 133.03751 | 134.04479 | 132.03023 | P | 3.75E+00 |
| 바라인 () | 117.07898 | 118.08626 | 116.0717 | P | 1.49E+00 |
| 이솔루신 | 131.09463 | 132.10191 | 130.08735 | P | 1.84E+00 |
| 신 | 131.09463 | 132.10191 | 130.08735 | P | 2.26E+00 |
| 히스티딘 | 155.06948 | 156.07676 | 154.0622 | P | 2.53E+00 |
| 티로신 | 181.07389 | 182.08117 | 180.06661 | P | 8.72E-02 |
| 리신 () | 146.10553 | 147.11281 | 145.09825 | P | 1.43E-01 |
| 알라닌 | 89.04768 | 90.05496 | 88.0404 | P | 1.12E+00 |
| 프롤린 | 115.06333 | 116.07061 | 114.05605 | P | 1.05E+00 |
| 시스테인 | 121.01975 | 122.02703 | 120.01247 | P | 8.22E-01 |
| 아스파라진 | 132.05349 | 133.06077 | 131.04621 | P | 1.08E+00 |
| 글루타민 | 146.06914 | 147.07642 | 145.06186 | P | 1.92E+00 |
| 구아닌 | 151.04941 | 152.05669 | 150.04213 | P | 5.47E+00 |
| 구아노신 | 283.09167 | 284.09895 | 282.08439 | P | 3.67E-01 |
| GMP | 363.058 | 364.06528 | 362.05072 | P | 7.17E-01 |
| 국내 총생산 | 443.02434 | 444.03162 | 442.01706 | P | 2.57E+00 |
| GTP | 522.99067 | 523.99795 | 521.98339 | P | 2.27E+00 |
| 앰프 | 347.06309 | 348.07037 | 346.05581 | P | 5.25E-01 |
| ADP | 427.02942 | 428.0367 | 426.02214 | P | 1.32E+00 |
| ATP | 506.99575 | 508.00303 | 505.98847 | P | 1.77E+00 |
| 나드 (주) | 665.12478 | 666.13206 | 664.1175 | P | 1.47E+00 |
| NAD + | 663.10912 | 664.1164 | 662.10184 | P | 3.03E+00 |
| 포도당** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | ||
| 과당 *** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 5.67E-01 |
| 만노스*** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 1.05E+00 |
| 갈라토세*** | 180.06339 | 181.07067 | 179.05611 | N | 9.00E-01 |
| 리보스 *** | 150.05283 | 151.06011 | 149.04555 | N | 1.10E+00 |
| 아라비노스*** | 150.05283 | 151.06011 | 149.04555 | N | 1.23E+00 |
| 과당 -6 인산염 *** | 260.02972 | 261.037 | 259.02244 | N | 6.60E+00 |
| 포도당-6-인산염*** | 260.02972 | 261.037 | 259.02244 | N | 4.27E+00 |
| 구연산 | 192.12 g | 193.034279 | 191.019726 | N | 9.33E-01 |
| 사과산 | 134.09 | 135.0288 | 133.014247 | N | 1.23E+00 |
| 피루빅 산 | 88.06 | 89.02332 | 87.008768 | N | 2.77E+00 |
표 4:LC-MS/MS 방법이 식별하고 수량화할 수 있는 다양한 수용성 대사산물 표준의 가장 낮은 농도입니다. 각 대사 산물 표준의 MS1 피크 영역은 이 대사 산물에 대해 가장 낮은 정량화 농도를 추정하는 데 사용되었습니다. 두 개의 독립적인 실험의 평균 값이 표시됩니다. 두 개의 독립적인 실험 각각에 대해 세 가지 기술 복제가 수행되었습니다. 참고: Threonine*는 감지할 수 있지만 테로닌의 화학 이소종인 호모세린과의 용용으로 인해 정량화될 수 없습니다. 포도당**는 여러 크로마토그래피 피크를 생성하기 때문에 식별할 수 없습니다. 대사 산물 표준 ***는 개별 샘플에서만 식별하고 수량화 할 수 있지만 대사 산물 표준 또는 대사 산물의 생물학적 혼합물의 혼합물에서는 식별되고 수량화 될 수 없습니다.
보충 표 1: 열 평형 후 zwitterionic 위상 및 역상 열(재료 표 참조)에 대해 동일한 대사산물 집합의 유지 시간(RT) 시프트 값입니다. 표는 그들의 소수성 및 소수성에서 서로 다른 대사산물의 명백한 세트에 대한 zwitterionic 상 및 역상 컬럼의 보존 재현성을 비교합니다. 이들 대사산물은 LC-MS/MS.의 도움으로 확인되었으며, 수성 대사산물(즉, NAD+, AMP, GMP, 아르기닌 및 글루타믹산)의 RT 시프트 값은 현저히 낮으며, 후상 열에 비해 피크 형상이 zwitterionic 상 열에 대해 실질적으로 더 선명하다는 점에 유의하게 확인되었다. 대조적으로, 소수성 대사산물(즉, 스테레산, 라우산 및 데카노산)의 RT 시프트 값은 현저히 낮으며, zwitterionic 상 열에 비해 역상 열에 대해 피크 형상이 실질적으로 선명하다. zwitterionic 상 및 역상 열의 도움으로 대사 산물의 크로마토그래피 분리에 대한 조건은 표 1 및 보충 표 2에각각 상세하다. 여기에서 보고된 RT 시프트 값은 다른 바이알에서 채취한 20가지 샘플의 측정을 기반으로 합니다. 샘플은 컬럼 평형 후 분석하였다. 각 샘플의 대사 산물은 5.0 × 108 효모 세포로부터 추출되었다. RT 시프트 값은 20개의 상이한 샘플(n =20)의 수단입니다. 페어링되지 않은 t 테스트에서 파생된 p 값은 두 컬럼을 두 샘플 유형 간의 동일한 분산과 비교하는 데 사용되었습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 재료의 표에 명명 된 역상 8 열에 대한 LC 조건이 연구에서 다른 대사 산물을 분리하는 데 사용. 컬럼 특성은 다음과 같습니다 : 150 x 2.1 mm, 5 μm 폴리머. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 3: LC-MS/MS 방법을 사용하여 복구 및 부음이 있는 모든 374개의 수용성 대사산물 목록입니다. 모든 대사산물은 동일한 LC 그라데이션 실행에서 회수되었으며, 보충 표 4에설명된 DDA(데이터 종속 수집) 단편화 알고리즘을 적용하고, 재료표에명명된 소프트웨어를 사용하여 인칭하였다. 211대사산물의 MS1 피크 모양(테이블의 상태가 빈 것으로 표시됨)은 정량화에 사용하기에 적절했으며, 각각의 MS2 스펙트럼은 mzCloud 스펙트럼 라이브러리와 전체 일치를 보였습니다. MS2 스펙트럼 38 대사 산물 (테이블에 있는 상태 d로 표시) 온라인 스펙트럼 라이브러리와 전체 일치했다. 여전히, 그들의 MS1 피크 모양정수화에 사용 하는 적절 한 되지 않았습니다. 125대사산물의 MS2 스펙트럼(테이블의 상태는 n으로 표시됨)은 온라인 스펙트럼 라이브러리와 일치하지 않았습니다. 이러한 대사 산물은 다음과 같이 "예측 조성 노드"(MS1 값의 정확한 일치, 일치하는 동위원소 수 및 동위원소의 수, 및 이론적 기준 표준의 것과 일치하는 동위원소 % 강도)를 사용하여 다음과 같이 부음하였다. 2) "ChemSpider 노드"를 사용하여 (MS1 값의 정확한 일치 및 온라인 스펙트럼 라이브러리와 MS2 스펙트럼의 유사성 일치 점수에 따라 대사 산물주석); 및 3) 대사 산물의 보존 시간(RT) 시프트 값을 사용하였습니다(이러한 값은 대사 산물의 물리적 구조 및 화학적 특성에 의존한다). 표에 나열된 대사 산물은 3개의 생물학적 복제물 에서 모두 발견되었으며, RT 시프트 값은 0.2분 <.
보충 표 4: 자료표에 명명된 소프트웨어의 도움으로 수용성 대사산물의 기여에 사용된 데이터 의존적 수집(DDA) 조각화 알고리즘.
보충 표 5: 재료표에 명명된 MS 시스템의 도움으로 다른 아미노산의 농도를 측정할 때 관찰한 전형적인 선형 동적 범위입니다. 여기에서 사용되는 MS 시스템은 다양한 대사 산물농도를 측정하기 위한 넓은(최소 2배의 크기) 선형 다이나믹 레인지를 가지고 있습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 사용하려면 아래에 설명된 예방 조치를 따르십시오. 클로로폼과 메탄올은 실험실 플라스틱 제품에서 다양한 물질을 추출합니다. 따라서 신중하게 처리하십시오. 이 두 유기 용매와 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 마십시오. 이러한 단계에 는 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용합니다. 사용하기 전에 클로로폼과 메탄올로 이 파이펫을 상승시보세요. 유기 용매에 강한 폴리 프로필렌으로 만든 마이크로 피펫 팁과 튜브만 사용하십시오. LC-MS/MS에 대한 샘플 준비 중에 유리 바이알의 모든 기포를 제거한 후 웰플레이트에 삽입합니다.
여기에 사용되는 zwitterionic 위상 열은 RT 시프트를 최소화하기 위해 각 실행 후 광범위한 재조정이 필요합니다. 열 재조정의 경우 컬럼의 약 20볼륨인 재조정 솔루션의 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 0.4mL/min의 증가된 유량으로 15분 동안 초기 이동 단계로 열을 다시 조절해야 합니다. 재조정 중에 컬럼의 손상을 방지하려면 제조업체가 권장하는 압력의 상한이하로 열 압력을 유지하십시오.
참고로, 역상 모드에서 작동하는 일부 혼합 분리 크로마토그래피 컬럼은 충전된 대사산물40,41의해상도를 허용한다. 이러한 혼합 분리 열은 여기에 사용되는 역상 열(재료 표참조)을 기반으로 하며, 충전40,41에따라 대사 산물을 분리할 수 있는 극성 임베디드 그룹을 포함한다.
여기서, 우리는 효모 세포로부터 추출된 많은 수용성 대사산물의 정량적 분석을 위한 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 계성 방법을 기술했습니다. 이 방법은 현재 이 목적을 위해 사용되고 있는 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이러한 장점은 다음과 같습니다. 첫째, 이 방법은 민감하며 0.05 pmol/μL의 농도에서 일부 수용성 대사산물의 식별 및 양을 확인할 수 있게 한다. 기존 LC-MS/MS 방법의 보고된 감도는3,22,27,42로낮습니다. 둘째, 상기 방법은 현재사용되는절차(31,33,38)에대해 보고된 것보다 세포 내 대사산물의 누출이 현저히 낮은 세포 대사산물을 유도하는 세포 담금질 절차를 사용한다. 따라서, 우리가 세포 담금질을 위해 개발한 절차는 현재 사용되는 절차가 수용성 대사산물의 세포내 농도를 과소 평가하는 정도를 낮춥다. 셋째, 기존의 LC-MS/MS 방법2,31,33과달리, 이 방법은 다양한 구조 이좀러와 많은 대사산물의 스테레오릭 형태를 구별한다. 이 대사 산물은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체를 포함합니다. 넷째, 우리는 원시 LC-MS/MS 데이터를 사용하여 광범위한 특정 대사 산물의 정확한 식별 및 수량을 위해 MS1 및 MS2의 광범위한 질량 스펙트럼 데이터베이스를 만드는 방법을 사용했습니다. 대조적으로, MS1 및 MS2의 기존 질량 스펙트럼 온라인 데이터베이스는 불완전한43,44,45. 다섯째, 이 방법은 단일 유형의 대사산물 추출을 사용하여 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 가진 수용성 대사산물을 회수합니다. 이러한 대사 산물의 다양성은 효모 세포3,22,27,46에서수용성 대사산물의 단일 단계 추출을 위한 대체 방법의 다양성을 크게 초과한다. 6, 기존의 LC-MS/MS 방법3,22,47,48과달리, 방법은 LC 컬럼의 단일 유형을 사용하여 용해성 대사산물의 다양한 구조적 및 기능적 클래스와 분리된다. 7, 이 방법은 효모 세포로부터 추출된 370개 이상의 수용성 대사산물의 식별 및 정량화를 가능하게 한다. 이러한 식별 가능한 및 정량화 대사산물의 수는 효모3,22,27,49,50에서비표적 메타볼로믹스의 다른 방법에 대해 보고된 대사산물의 수를 초과한다.
메서드에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이러한 제한 사항은 다음과 같습니다. LC에 의한 대사산물 분리에 사용되는 zwitterionic 상 열은 각 실행 후 광범위한 재조정이 필요합니다. 더욱이, 이 방법은 수용성, 친수성 대사산물의 비표적 메타볼로믹스에 대해서만 효율적입니다. 더욱이, 탄수화물의 다른 이소성 형태 (과당, 포도당 및 갈라토오스의 이소성 포함)는 방법의 도움으로 정량화 될 수 없다. 이는 이 방법에 사용된 zwitterionic-phase 컬럼이 다른 대사산물과의 혼합물에 존재할 때 이러한 탄수화물 이좀러를 서로 분리할 수 없기 때문이다. 게다가, 이 탄수화물은 방법에 사용된 zwitterionic 상 열에 크로마토그래피 도중 다중 피크를 생성하기 때문에 포도당을 확인하기 위한 방법을 이용할 수 없습니다. 마지막으로, 크로마토그래피에 의한 대사산물 분리 시 이소머 호모세린과 이 아미노산의 용액으로 인해 이 방법의 도움으로 정량화될 수 없다.
우리는 신진 효모 S. cerevisiae의수용성 metabolome에 노화 관련 변화를 연구하기 위해이 LC-MS / MS 방법을 사용합니다. 우리는 또한 얼마나 많은 노화 지연 유전, 규정식 및 약리학적 인 내정간섭이 그들의 연대순 노화 도중 효모 세포의 수용성 metabolome에 영향을 미치는지 조사하기 위하여 이 방법을 채택합니다. LCD-MS/MS 방법은 다재다능함, 견고성 및 감도 때문에 진화적으로 먼 진핵 생물의 수용성 메타볼로메의 정량적 평가에 성공적으로 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 토론에 대한 티토렌코 연구소의 현재와 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분광학의 생물학 응용 센터를 인정합니다, 구조 및 기능 유전체학센터, 및 미해결 서비스를 위한 현미경 및 세포 화상 진찰 센터 (콩코르디아 대학에 모두). 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482 CRDPJ 515900 - 17). K.M. 콩코르디아 대학 아르만드 C. 아캄볼트 펠로우십과 콩코르디아 대학 예술 과학 우수 학장의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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