Bildgebung der podozytischen Proteine Nephrin, Actin und Podocin mit Erweiterungsmikroskopie
Summary
Die vorgestellte Methode ermöglicht die Visualisierung fluoreszierend markierter zellulärer Proteine mit Erweiterungsmikroskopie, die zu einer Auflösung von 70 nm auf einem herkömmlichen Mikroskop führt.
Abstract
Die Störung des glomerulären Filters, der aus dem glomerulären Endothel, der glomerulären Kellermembran und den Podozyten besteht, führt zu Albuminurie. Podozyten-Fußprozesse enthalten Aktinbündel, die an zytoskelettale Adapterproteine wie Podocin binden. Diese Adapterproteine, wie Podocin, verbinden das Rückgrat des glomerulären Schlitzzwerchfells, wie Nephrin, mit dem Aktin-Zytoskelett. Die Untersuchung der Lokalisation und Funktion dieser und anderer podozytischer Proteine ist für das Verständnis der Rolle des Glomerularfilters bei Gesundheit und Krankheit von wesentlicher Bedeutung. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, Actin, Podocin und Nephrin in Zellen mit Superauflösung simtogebungsbildn auf einem herkömmlichen Mikroskop zu visualisieren. Erstens werden Zellen mit einer herkömmlichen Immunfluoreszenztechnik gefärbt. Alle Proteine innerhalb der Probe werden dann kovalent an einem anschwellenden Hydrogel verankert. Durch die Verdauung mit Proteinase K werden strukturelle Proteine spaltet, was eine isotropische Schwellung des Gels im letzten Schritt ermöglicht. Die Dialyse der Probe in Wasser führt zu einer 4-4,5-fachen Ausdehnung der Probe und die Probe kann über ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden, was eine mögliche Auflösung von 70 nm ergibt.
Introduction
Albuminurie ist ein Ersatzparameter des kardiovaskulären Risikos und resultiert aus einer Störung des Glomerularfilters1. Der glomeruläre Filter besteht aus dem fenestrated Endothel, der glomerulären Kellermembran und dem durch Podozyten gebildeten Schlitzzwerchfell. Primäre und sekundäre Fußprozesse von Podozyten wickeln sich um die Kapillarwand des Glomerulums2. Die empfindliche Struktur der Fußprozesse wird durch kortikale Aktinbündel aufrechterhalten, die auch als Anker für mehrere Spaltmembranproteine und andere Adapterproteine dienen2. Das Rückgratprotein des Spaltzeswirdn stutztisch heißt Nephrin und interagiert auf homophile Weise mit Nephrinmolekülen gegensätzlicher Podozyten. Über verschiedene Adapterproteine wird Nephrin mit dem Aktin-Zytoskelett2,3verbunden. Mutationen im Nephrin-kodierenden Gen NPHS1 führen zu einem nephrotischen Syndrom des finnischenTyps 4.
Eines der interagierenden Proteine von Nephrin ist Podocin, ein haarförmiges Protein der Stomatin-Familie3. Podocin rekrutiert Nephrin zu Lipidflößen und verbindet es mit dem Aktin-Zytoskelett5. Podocin wird durch das NPHS2-Gen kodiert. Mutationen in NPHS2 führen zu steroidresistentem nephrotischem Syndrom6.
Um Aktin-Adapterproteine zu visualisieren und mitzulokalisieren, können Immunfluoreszenztechniken eingesetzt werden. Leider begrenzt die Beugungsbarriere des Lichts die Auflösung herkömmlicher Fluoreszenzmikroskope auf 200-350 nm7. Neuartige Mikroskopietechniken, z.B. stimulierte Emissionserschöpfung (STED)8, photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)9, stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM oder dSTORM) oder Bodenzustandslöschmikroskopie gefolgt von individueller Molekülrückführung (GSDIM)9,10,11, ermöglichen eine Auflösung bis ca. 10 nm. Diese Superauflösungstechniken erfordern jedoch sehr teure Mikroskope, gut ausgebildetes Personal und sind daher in vielen Laboratorien nicht verfügbar.
Die Erweiterungsmikroskopie (ExM) ist eine neuartige und einfache Technik, die eine hochauflösende Bildgebung mit herkömmlichen Mikroskopen ermöglicht und potenziell einer großen Forschungsgemeinschaft zur Verfügung steht12. In der Proteinretentionsexpansionsmikroskopie (proExM) ist die Vonsamkeitsprobe (Zellen oder Gewebe) fixiert und mit Fluorophoren13gefärbt. Proteine innerhalb der Probe werden dann kovalent durch ein kleines Molekül (6-((Acryloyl)amino)Hexanosäure, Succinimidylester, AcX) in ein anschwellendes Hydrogel13verankert. Durch enzymatische Verdauung mit Proteinase K (ProK) behalten Proteine und Fluorophore ihre relative Position innerhalb des Gels nach der Ausdehnung13bei. Nach Schwellung des Gels dehnt sich die Probe bis zum 4,5-fachen (90-fache volumetrische Ausdehnung) aus, was zu einer effektiven lateralen Auflösung von ca. 60-70 nm (300 nm/4,5) führt. Modifikationen dieser Technik können sogar eine 10-fache Erweiterung ermöglichen (1.000-fache volumetrische Expansion), wodurch eine Auflösung von 20-30 nm bei herkömmlichen Mikroskopen14,15,16.
Glomeruläre Strukturen von Maus und menschlichen Nieren wurden über ExM17visualisiert. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes proExM-Protokoll vor, um Superauflösungsbilder von F-Actin und dem Actin-Adapter-Proteinpodocin in Zellen mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop zu visualisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Methode ermöglicht es dem Forscher, zelluläre Proteine, z.B. Podocin, Nephrin und zytoskelettale Komponenten, z.B. F-Actin, zu visualisieren. Innerhalb dieses Protokolls werden transfizierte cos7-Zellen als Modell verwendet, um die Wechselwirkung von Spaltmembranproteinen mit F-Actin zu untersuchen. Leider drücken verewigte Podozytenzelllinien nicht genügend endogene Mengen an Spaltmembranproteinenaus 19.
Mit dieser Methode können zelluläre Protei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Blanka Duvnjak und Nikola Kuhr für ihre hervorragende technische Unterstützung.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
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