확장 현미경 검사법을 가진 Podocytic 단백질 Nephrin, 액틴 및 포도신의 화상 진찰
Summary
제시된 방법은 확장 현미경으로 형광 표지된 세포 단백질의 시각화를 가능하게 하고 전통적인 현미경에 70 nm의 해상도로 이끌어 냅니다.
Abstract
구체 내피, 구체 지하 막 및 podocytes로 구성된 구체 필터의 중단은 알부무뇨증을 초래한다. Podocyte 발 프로세스는 podocin와 같은 세포켈레탈 어댑터 단백질에 결합하는 액틴 번들을 포함합니다. 포도신과 같은 어댑터 단백질은 네프린과 같은 구슬빛 횡격막의 중추를 액틴 세포 골격에 연결합니다. 이들과 그밖 podocytic 단백질의 현지화 그리고 기능을 공부하는 것은 건강과 질병에서 구체 필터의 역할의 이해에 필수적입니다. 제시된 프로토콜은 사용자가 기존의 현미경에 슈퍼 해상도 이미징을 사용하여 세포에서 액틴, 포도신 및 nephrin을 시각화할 수 있게 합니다. 첫째, 세포는 종래의 면역 형광 기술로 염색된다. 시료 내의 모든 단백질은 팽창 가능한 하이드로겔에 공유적으로 고정됩니다. 단백질제 K를 함유한 소화를 통해 구조 단백질은 마지막 단계에서 겔의 이소열대 부종을 허용합니다. 물에서 샘플의 투석은 샘플의 4-4.5 배 팽창을 초래하고 샘플은 기존의 형광 현미경을 통해 이미지 될 수있다, 70 nm의 잠재적 인 해상도를 렌더링.
Introduction
알부미뇨증은 심혈관 위험의 대리 매개 변수이며 사구형 필터1의중단으로 인한 결과입니다. 구체 필터는 포도세포에 의해 형성된 회향성 내피, 구체 지하 막 및 슬릿 다이어프램으로 구성됩니다. 포도세포의 기본 및 이차 발 공정은구체2의 모세관 벽을 감싸는다. 발 과정의 섬세한 구조는 또한 다중 슬릿 다이어프램 단백질 및 기타 어댑터 단백질2에대한 앵커 역할을 하는 피질 액틴 번들에 의해 유지된다. 슬릿 다이어프램의 백본 단백질은 신장이라고 불리며 반대 되는 podocytes의 네프린 분자와 동종 방식으로 상호 작용합니다. 다양한 어댑터 단백질을 통해, 네프린은 액틴 세포골격2,3에연결된다. 신장 인코딩 유전자 NPHS1의 돌연변이는 핀란드 형4의신 증후군으로 이어집니다.
네프린의 상호 작용 단백질 중 하나는 스토마틴 가족3의헤어핀 과 같은 단백질인 포도신입니다. 포도신은 지질 뗏목에 nephrin을 모집하고 액틴 세포 골격5에연결합니다. 포도신은 NPHS2 유전자에 의해 인코딩된다. NPHS2의 돌연변이는 스테로이드 저항하는 신증후군6로이끌어 낸다.
액틴 어댑터 단백질을 시각화하고 공동 국소화하기 위해 면역 형광 기술이 사용될 수 있다. 불행히도, 빛의 회절 장벽은 종래의 형광 현미경의 해상도를 200-350 nm7로제한한다. 새로운 현미경 기술, 예를 들어, 자극 방출 고갈 (STED)8,사진 활성화 국소 현미경 (PALM)9,금세 광학 재건 현미경 검사법 (STORM 또는 dSTORM) 또는 지상 상태 삭제 현미경 검사법은 개별 분자 반환 (GSDIM)9,10,11,약 10 nm까지 해상도를 가능하게한다. 그러나 이러한 슈퍼 해상도 기술은 고가의 현미경, 잘 훈련된 인력을 필요로 하므로 많은 실험실에서 사용할 수 없습니다.
확장 현미경 검사법(ExM)은 종래의 현미경으로 초분해능 이미징을 가능하게 하고 대형 연구커뮤니티(12)에서잠재적으로 사용할 수 있는 신작이고 간단한 기술이다. 단백질 보존 팽창 현미경 검사법(proExM)에서 관심 있는 샘플(세포 또는 조직)은형광구(13)로고정및 염색된다. 시료 내의 단백질은 그 때 작은 분자에 의해 공유적으로 고정됩니다 (6-((아크릴)아미노산, succinimidyl 에스테르, AcX) 팽창 하이드로겔(13)로. 단백질 효소 K(ProK)를 통한 효소 소화를 통해 단백질과 형광은 팽창 후 겔 내에서 상대적인 위치를유지한다 13. 젤의 붓기 후에, 견본은 대략 60-70 nm (300 nm/4.5)의 효과적인 측량 분해로 이끌어 내는 4.5 배 (90 배 체피 확장)까지 확장합니다. 이 기술의 수정은 10배 의 팽창(1,000배 의 체적 확장)을 허용할 수 있으며, 종래의 현미경14,15,16에대해 20-30 nm의 해상도를 렌더링할 수 있다.
마우스와 인간의 신장의 구체 구조는 ExM17을통해 시각화되었습니다. 본 논문에서, 우리는 기존의 형광 현미경을 사용하여 세포 내F 액틴및 액틴 어댑터 단백질 podocin의 슈퍼 해상도 이미지를 시각화하는 상세한 proExM 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 방법은 조사자가 세포 단백질, 예를 들면, podocin, nephrin 및 cytoskeletal 분대, 예를 들면, F-actin를 구상하는 것을 가능하게 합니다. 이 프로토콜 내에서, 전감염된 cos7 세포는 F-actin와 슬릿 다이어프램 단백질의 상호 작용을 연구하는 모델로 이용됩니다. 불행하게도, 불멸의 podocyte 세포주 슬릿 다이어프램 단백질의 충분한 내인성 양을 표현하지않는다(19).
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 블랭카 듀브낙과 니콜라 쿠어에게 훌륭한 기술 지원을 해 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton – Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
