Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão
Summary
O método apresentado permite a visualização de proteínas celulares fluorescentes com microscopia de expansão levando a uma resolução de 70 nm em um microscópio convencional.
Abstract
A interrupção do filtro glomerular composto pelo endotélio glomerular, membrana glomerular do porão e podocitos, resulta em albuminúria. Os processos do pé podocyte contêm feixes de actina que se ligam a proteínas adaptadoras citoesquelletal, como a podocina. Essas proteínas adaptadoras, como a podocina, ligam a espinha dorsal do diafragma de fenda glomerular, como a nefrina, ao citoesqueleto de actina. Estudar a localização e função dessas e outras proteínas podocíticas é essencial para a compreensão do papel do filtro glomerular na saúde e na doença. O protocolo apresentado permite que o usuário visualize actina, podocina e nefrina em células com imagens de super resolução em um microscópio convencional. Primeiro, as células são manchadas com uma técnica convencional de imunofluorescência. Todas as proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas a um hidrogel inchado. Através da digestão com proteinase K, as proteínas estruturais são cortadas permitindo o inchaço isotropical do gel na última etapa. A diálise da amostra na água resulta em uma expansão de 4-4,5 vezes da amostra e a amostra pode ser imageda através de um microscópio de fluorescência convencional, tornando uma resolução potencial de 70 nm.
Introduction
Albuminúria é um parâmetro substituto de risco cardiovascular e resulta da interrupção do filtro glomerular1. O filtro glomerular é composto do endotélio fenestrado, da membrana glomerular do porão e do diafragma cortado formado por podocitos. Processos primários e secundários de pés de podocitos envolvem a parede capilar do glomerulum2. A estrutura delicada dos processos dos pés é mantida por feixes de actina cortical que também servem como âncoras para proteínas de diafragma de fenda múltipla e outras proteínasadaptadoras 2. A proteína backbone do diafragma é chamada de nefrina e interage de forma homofílica com moléculas de nefetos de podocitos opostos. Através de diversas proteínas adaptadoras, a nefrina está ligada ao citoesqueleto de actina2,3. Mutações no gene de codificação de nefrina NPHS1 levam à síndrome nefrótica do finlandês tipo4.
Uma das proteínas interativas de nefrina é a podocina, uma proteína semelhante ao grampo de cabelo da família estomatina3. Podocin recruta nefrina para jangadas lipídicas e a liga ao citoesqueleto de actina5. Podocina é codificado pelo gene NPHS2. Mutações no NPHS2 levam à síndrome nefrótica resistente a esteroides6.
Para visualizar e co-localizar proteínas adaptadoras de actina, podem ser utilizadas técnicas de imunofluorescência. Infelizmente, a barreira de difração da luz limita a resolução de microscópios convencionais de fluorescência para 200-350 nm7. Novas técnicas de microscopia, por exemplo, estimuladas pelo esgotamento das emissões (STED)8,microscopia de localização ativada por foto (PALM)9,microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM ou dSTORM) ou microscopia de exclusão de estado terrestre seguida pelo retorno individual da molécula (GSDIM)9,10,11, permitem uma resolução de aproximadamente 10 nm. No entanto, essas técnicas de super resolução exigem microscópios altamente caros, pessoal bem treinado e, portanto, não estão disponíveis em muitos laboratórios.
A microscopia de expansão (ExM) é uma técnica nova e simples que permite imagens de super resolução com microscópios convencionais e está potencialmente disponível para uma grande comunidade de pesquisa12. Na microscopia de expansão de retenção de proteínas (proExM), a amostra de interesse (células ou tecidos) é fixa e manchada com fluoroforos13. As proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas por uma pequena molécula (6-(Acryloyl)amino)ácido hexanoico, éster succinimidyl, AcX) em um hidrogel inchado13. Através da digestão enzimática com proteinase K (ProK), proteínas e fluoroforos mantêm sua posição relativa dentro do gel após a expansão13. Após o inchaço do gel, a amostra expande-se até 4,5 vezes (expansão volutiva de 90 vezes) levando a uma resolução lateral eficaz de aproximadamente 60-70 nm (300 nm/4.5). Modificações desta técnica podem até permitir uma expansão de 10 vezes (expansão volutiva de 1.000 vezes), tornando uma resolução de 20-30 nm nos microscópios convencionais14,15,16.
Estruturas glomerulares de camundongos e rins humanos foram visualizadas via ExM17. Dentro deste artigo, apresentamos um protocolo proExM detalhado para visualizar imagens de super resolução de F-actin e podocina de proteína actina dentro das células usando um microscópio de fluorescência convencional.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado permite ao pesquisador visualizar proteínas celulares, por exemplo, podocina, nefrina e componentes citoesqueletal, por exemplo, F-actin. Dentro deste protocolo, as células cos7 transfectadas são usadas como modelo para estudar a interação de proteínas de diafragma cortadas com F-actin. Infelizmente, as linhas celulares podocyte imortalizadas não expressam quantidades endógenas suficientes de proteínas de diafragma cortadas19.
Com este mé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Blanka Duvnjak e Nikola Kuhr por sua excelente assistência técnica.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
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