Podosit Proteinleri Nephrin, Actin ve Podocin'in Genleşme Mikroskopisi ile Görüntülenmesi
Summary
Sunulan yöntem, floresan etiketli hücresel proteinlerin, geleneksel bir mikroskopta 70 nm çözünürlüğe yol açan genleşme mikroskopisi ile görselleştirilmesini sağlar.
Abstract
Glomerüler endotel, glomerüler bodrum membranı ve podositlerden oluşan glomerüler filtrenin bozulması albüminüri ile sonuçlanır. Podosit ayak prosesleri, podocin gibi sitoskeletal adaptör proteinlerine bağlanan aktin demetleri içerir. Podocin gibi adaptör proteinleri, nefrin gibi glomerüler yarık diyaframın omurgasını aktin sitoskeleton’a bağlar. Bu ve diğer podositik proteinlerin lokalizasyonunu ve işlevini incelemek, glomerüler filtrenin sağlık ve hastalıktaki rolünün anlaşılması için gereklidir. Sunulan protokol, kullanıcının geleneksel bir mikroskopta süper çözünürlüklü görüntüleme ile hücrelerde akrin, podokin ve nefrin görselleştirmesini sağlar. İlk olarak, hücreler geleneksel bir immünoresans tekniği ile lekelenir. Numunedeki tüm proteinler daha sonra kovalently şişme bir hidrojel’e tutturulır. Proteinaz K ile sindirim yoluyla, yapısal proteinler son adımda jelin izotropik şişmesine izin vererek bölünür. Numunenin suda diyaliz edilmesi, numunenin 4-4,5 kat genişlemesine neden olur ve numune geleneksel bir floresan mikroskobu ile görüntülenebilir ve 70 nm’lik potansiyel bir çözünürlük sağlar.
Introduction
Albüminüri kardiyovasküler riskin taşıyıcı bir parametresidir ve glomerüler filtrenin bozulmasından kaynaklanır1. Glomerüler filtre fenestratlı endotel, glomerüler bodrum zarı ve podositlerin oluşturduğu yarık diyaframdan oluşur. Podositlerin birincil ve ikincil ayak süreçleri glomerulum2’ninkılcal duvarının etrafına sarılır. Ayak proseslerinin hassas yapısı, birden fazla yarık diyafram proteini ve diğer adaptör proteinleri için çapa görevi gören kortikal akrin demetleri tarafından korunur2. Yarık diyaframın omurga proteinine nephrin denir ve karşıt podositlerin nefrin molekülleriyle homofilik bir şekilde etkileşime girer. Çeşitli adaptör proteinleri aracılığıyla, nephrin aktin sitoskeleton2,3ile bağlantılıdır. Nefrin kodlayıcı gen NPHS1’deki mutasyonlar Finlandiya tip4’ünnefrotik sendromuna yol açar.
Nephrin’in etkileşime giren proteinlerinden biri, stomatin ailesinin saç tokası benzeri bir proteini olan podocin3. Podocin lipid salları için nephrin işe ve actin sitoskeleton5bağlar . Podocin NPHS2 geni tarafından kodlanmıştır. NPHS2’deki mutasyonlar steroid dirençli nefrotik sendroma yol açar6.
Akin adaptör proteinlerini görselleştirmek ve birlikte lokalize etmek için immünofluoresans teknikleri kullanılabilir. Ne yazık ki, ışığın kırınım bariyeri geleneksel floresan mikroskopların çözünürlüğünü 200-350 nm7ile sınırlar. Yeni mikroskopi teknikleri, örneğin uyarılmış emisyon tükenmesi (STED)8, foto-aktif lokalizasyon mikroskopisi (PALM)9, stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM veya dSTORM) veya zemin durumu silme mikroskopisi ve ardından bireysel molekül dönüşü (GSDIM) 9,10,11, yaklaşık 10 nm’ye kadar bir çözünürlük sağlar. Bununla birlikte, bu süper çözünürlük teknikleri çok pahalı mikroskoplar, iyi eğitimli personel gerektirir ve bu nedenle birçok laboratuvarda mevcut değildir.
Genleşme mikroskopisi (ExM), geleneksel mikroskoplarla süper çözünürlüklü görüntüleme sağlayan ve büyük bir araştırma topluluğu için potansiyel olarak kullanılabilen yeni ve basit bir tekniktir12. Protein tutma genleşme mikroskopisinde (proExM), ilgi örneği (hücreler veya doku) sabitlenir ve floroforlarla lekelenir13. Numune içindeki proteinler daha sonra küçük bir molekül (6-(((Acryloyl)amino)heksanoik asit, süksinimsal ester, AcX) tarafından koordine bir şekilde şişme bir hidrojel13’etutturulr. Proteinaz K (ProK) ile enzimmatik sindirim yoluyla, proteinler ve floroforlar genişlemeden sonra jel içindeki göreceli konumlarınıkorurlar 13. Jelin şişmesi sonrasında, numune 4,5 kata (90 kat hacimsel genleşme) kadar genişleyerek yaklaşık 60-70 nm (300 nm/4,5) etkili bir yanal çözünürlüğe sahiptir. Bu tekniğin modifikasyonları, geleneksel mikroskoplarda14,15,16’da20-30 nm çözünürlük oluşturarak 10 kat genişlemeye(1.000kat hacimsel genişleme) bile izin verebilir.
Fare ve insan böbreklerinin glomerüler yapıları ExM17ile görselleştirilmiştir. Bu yazıda, geleneksel bir floresan mikroskobu kullanarak F-actin ve aksin adaptörü protein podocin’in süper çözünürlüklü görüntülerini görselleştirmek için ayrıntılı bir proExM protokolü sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan yöntem, araştırmacının hücresel proteinleri, örneğin podocin, nephrin ve sitoskeletal bileşenleri, örneğin F-actin’i görselleştirmesini sağlar. Bu protokolde, transfected cos7 hücreleri, yarık diyafram proteinlerinin F-actin ile etkileşimini incelemek için bir model olarak kullanılır. Ne yazık ki, ölümsüzleştirilmiş podosit hücre hatları yeterli miktarda yarık diyafram proteinini ifade etmez19.
Bu yöntemle hücresel proteinler gelen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Blanka Duvnjak ve Nikola Kuhr’a mükemmel teknik yardımları için teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton – Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
