Visualisierung von lungenzellulären Anpassungen während kombinierter Ozon- und LPS-induzierter akuter Lungenverletzungen bei Der Maus
Summary
Kombinierte Ozon- und bakterielle Endotoxin-exponierte Mäuse zeigen einen weit verbreiteten Zelltod, einschließlich des von Neutrophilen. Wir beobachteten zelluläre Anpassungen wie die Störung der zytoskelettalen Lamellipodie, eine erhöhte zelluläre Expression der komplexen V-ATP-Synthase-Untereinheit β und Angiostatin in der broncho-alveolären Lavage, die Unterdrückung der Lungenimmunantwort und eine verzögerte Neutrophilenrekrutierung.
Abstract
Die Lunge ist ständig mit direkten und indirekten Beleidigungen in Form von sterilen (Partikeln oder reaktiven Toxinen) und infektiösen (bakteriellen, viralen oder pilzlichen) Entzündlichenzuständen konfrontiert. Eine überwältigende Wirtsreaktion kann zu einer beeinträchtigten Atmung und einer akuten Lungenverletzung führen, die durch lungenneutrophile Rekrutierung als Folge der pathologischen Immun-, Koagulativ- und Gewebeumbaureaktion des Wirts gekennzeichnet ist. Empfindliche mikroskopische Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Anpassungen der Mauslunge als Reaktion auf niedrig dosiertes (0,05 ppm) Ozon, einen starken Umweltschadstoff in Kombination mit bakteriellem Lipopolysaccharid, einem TLR4-Agonisten, sind entscheidend, um die Entzündungs- und Reparaturmechanismen des Wirts zu verstehen. Wir beschreiben eine umfassende fluoreszierende mikroskopische Analyse verschiedener Lungen- und systemischer Körperkompartimente, nämlich der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit, des Lungengefäßperfusats, der kryosektionen linken Lunge und des sternalen Knochenmarkperfusatsats. Wir zeigen Schäden an alveolären Makrophagen, Neutrophilen, Lungenparenchymgewebe sowie Knochenmarkzellen in Korrelation mit einer verzögerten (bis zu 36-72 h) Immunantwort, die durch diskrete Chemokingradienten in den analysierten Kompartimenten gekennzeichnet ist. Darüber hinaus präsentieren wir lungenextrazelluläre Matrix und zelluläre zytoskelettale Interaktionen (Aktin, Tubulin), mitochondriale und reaktive Sauerstoffspezies, antikoagulatives Plasminogen, sein antiangiogenes Peptidfragment Angiostatin, die mitochondrialen ATP-Synthase-Komplex-V-Untereinheiten, α und β. Diese Surrogatmarker können, wenn sie mit adäquaten zellbasierten In-vitro-Assays und In-vivo-Tierbildgebungsverfahren wie intravitaler Mikroskopie ergänzt werden, wichtige Informationen zum Verständnis der Lungenreaktion auf neuartige immunmodulatorische Wirkstoffe liefern.
Introduction
Akute Lungenverletzung (ALI) ist eine entscheidende pathologische Reaktion der Lunge auf infektiöse oder andere schädliche Reize, die durch die gleichzeitige Aktivierung des koagulativen, fibrinolytischen und angeborenen Immunsystems gekennzeichnet ist1. Neutrophile erkennen sofort mikrobielle sowie intrazelluläre Schädigungsmuster durch die Toll-like-Rezeptor (TLR) Familie2,3,4. Neutrophile setzen vorgeformte Zytokine und zytotoxische Granulatinhalte frei, die dann Kollateralgewebeschäden verursachen können. Die daraus resultierende Alveolarschädigung wird durch sekundären Zelltod getrübt, der zur Freisetzung von Molekülen wie Adenosintriphosphat (ATP)5führt und damit in einen Teufelskreis der Immundysregulation einleitet.
Ein ungelöstes Problem im Verständnis von ALI bezieht sich auf die Frage, wie die Verletzung innerhalb der Alveolarmembran ausgelöst wird. Der Elektronentransportkomplex V, F1F0 ATP-Synthase, ist ein mitochondriales Protein, von dem bekannt ist, dass es während einer Entzündung ubiquitär auf der Plasmamembran von Zellen (einschließlich Endothel, Leukozyten, Epithel) exprimiert wird. Das Zellzytoskelett, das aus Aktin und Tubulin besteht, beherbergt viele zellform- und funktionsmodulierende sowie mitochondriale Proteine. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Blockade der ATP-Synthase durch ein endogenes Molekül, Angiostatin, die Rekrutierung, Aktivierung und Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Lungenentzündung zum Schweigen bringt6. So könnten sowohl biochemische (ATP-Synthase) als auch Immunmechanismen (TLR4) die Alveolarbarriere während einer Lungenentzündung regulieren.
Die Exposition gegenüber Ozon (O3), einemUmweltschadstoff, beeinträchtigt die Lungenfunktion, erhöht die Anfälligkeit für Lungeninfektionen, und kurze niedrige O3-Expositionen erhöhen das Mortalitätsrisiko bei Personen mit zugrunde liegenden kardiorespiratorischen Erkrankungen7,8,9,10,11,12,13,14. Somit liefert die Exposition gegenüber physiologisch relevanten Konzentrationen vonO3 ein aussagekräftiges Modell von ALI zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der Entzündung7,8. Unser Labor hat kürzlich ein murines Modell von niedrig dosiertemO3 induziertem ALI15etabliert. Nach Durchführung einer Dosis- und Zeitreaktion auf niedrigeO3-Konzentrationen beobachteten wir, dass die Exposition bei 0,05 ppm O3 für 2 h eine akute Lungenverletzung induziert, die durch die AtP-Synthase-Komplex-V-Untereinheit β (ATPβ) und die Angiostatinexpression gekennzeichnet ist, ähnlich dem LPS-Modell. Die intravitale Lungenbildgebung zeigte eine Desorganisation der alveolären Aktin-Mikrofilamente, die auf eine Lungenschädigung hinweisen, und eine Ablation der Alveolarseptum-REAKTIVSauerStoffspezies (ROS) (was auf eine Aufhebung der Ausgangszellsignalisierung hinweist) und das mitochondriale Membranpotential (was auf einen akuten Zelltod hinweist) nach 2 h Exposition bei 0,05 ppm O315, was mit einer heterogenen Lungen-18-FDG-Retention16,Neutrophilenrekrutierung und Zytokinfreisetzung, insbesondere IL-16 und SDF-1α, korrelierte. Die Botschaft aus unseren jüngsten Studien ist, dass O 3 eine exponentiell hoheToxizität erzeugt, wenn es bei Konzentrationen unterhalb der zulässigen Grenzwerte von 0,063 ppm über 8 h (pro Tag) für die Exposition des Menschen exponiert wird. Wichtig ist, dass es kein klares Verständnis darüber gibt, ob diese subklinischen O3-Expositionen TLR4-vermittelte Mechanismen wie durch bakterielles Endotoxin17modulieren können. Daher untersuchten wir einDual-Hit-O-3- und LPS-Expositionsmodell und beobachteten die immun- und nicht-immunen zellulären Anpassungen.
Wir beschreiben eine umfassende fluoreszierende mikroskopische Analyse verschiedener Lungen- und systemischer Körperkompartimente, nämlich der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit (d.h. BAL), die die alveolären Räume beprobt, der Lungengefäßdifugelat (d.h. LVP), der das Lungengefäßgefäß abstimmt, und des alveolären septalen Interstitiums im Falle einer kompromittierten Endothelbarriere, der linken Lungenkriosektionen, um die im lavatierten Lungengewebe verbleibenden parenchymalen und adhärenten Leukozyten zu untersuchen , peripheres Blut, das die zirkulierenden Leukozyten darstellt, und das Sternal- und Femurknochenmark perfusiert, die die proximalen bzw. distalen Stellen der hämatopoetischen Zellmobilisierung während der Entzündung abtasten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in der aktuellen Studie vorgestellten Methoden unterstreichen die Nützlichkeit der Multikompartimentanalyse zur Untersuchung mehrerer zellulärer Ereignisse während einer Lungenentzündung. Wir haben die Ergebnisse in Tabelle 2zusammengefasst. Wir und viele Labore haben die murine Reaktion auf die intranasale LPS-Instillation umfassend untersucht, die durch eine schnelle Rekrutierung von Lungenneutrophilen gekennzeichnet ist, die zwischen 6-24 Stunden ihren Höhepunkt erreicht, woraufhin die Auflö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die durchgeführte Forschung wird durch den NSERC-Zuschuss des Präsidenten sowie durch Start-up-Mittel des Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finanziert. Das Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation wird von Innovation Saskatchewan finanziert. Die Fluoreszenzbildgebung wurde im WCVM Imaging Centre durchgeführt, das von NSERC finanziert wird. Jessica Brocos (MSc Student) und Manpreet Kaur (MSc Student) wurden aus den Start-up-Mitteln des Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finanziert.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
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