Summary
결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.
Abstract
폐는 멸균 (입자 또는 반응성 독소) 및 전염성 (세균성, 바이러스 또는 곰팡이) 염증 조건의 형태로 직접적이고 간접적인 모욕에 지속적으로 직면합니다. 압도적인 숙주 반응은 병리학적 숙주 면역, 응압 및 조직 리모델링 반응의 결과로 폐 호중구 모집을 특징으로 하는 손상된 호흡 및 급성 폐 손상을 초래할 수 있습니다. 소뇨폐 세포 적응을 시각화하고 정량화하는 민감한 현미경 방법은 저용량(0.05 ppm) 오존에 대응하여, TLR4 작용제인 세균성 리포폴리사카라이드와 함께 강력한 환경 오염물질로 숙주 염증 및 수리 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지-폐포라 라베지 액체, 폐 혈관 난투, 좌측 폐 극저섹션 및 흉골 골수 투과구의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다. 당사는 분석된 구획에서 이산 케모킨 그라데이션에 의해 표시되는 지연(최대 36-72h) 면역 반응과 상관되는 골수 세포뿐만 아니라 폐포성 대식세포의 손상을 보여줍니다. 또한 폐 세포 외 매트릭스 및 세포 세포 종편 상호 작용 (액틴, 튜룰린), 미토콘드리아 및 반응성 산소 종, 항 응고 성 플라스미노겐, 항 혈관 신생 펩타이드 단편 혈관 산기 세포 혈관, 미토콘드리아 ATP 시네시아 복합 V 서브 유닛, α 및 β 제시합니다. 이러한 대리 마커는 적절한 체외 세포 기반 분석술및 생체 내 미생물 현미경 검사법과 같은 생체 내 동물 이미징 기술로 보충될 때, 새로운 면역 조절제에 대한 폐 반응을 이해하는 쪽으로 중요한 정보를 제공할 수 있다.
Introduction
급성 폐 손상(ALI)은 응고, 섬유성 및 선천성 면역 계통1의동시 활성화에 의해 표시되는 전염성 또는 기타 유해한 자극에 대한 폐의 중요한 병리학 반응이다. 호중구는 즉시 톨과 같은 수용체 (TLR) 패밀리2,3,4를통해 미생물 및 세포 내 손상 패턴을 감지합니다. Neutrophils는 그 때 부수적인 조직 손상을 일으키는 원인이 될 수 있는 미리 형성된 사이토카인 및 세포독성 과립 내용을 풀어 놓습니다. 이어지는 폐포 손상은 아데노신 삼위산염 (ATP)5와같은 분자의 방출로 이어지는 이차 세포 죽음으로 손상되어 면역 dysregulation의 악순환에서 설정됩니다.
ALI의 이해에 해결되지 않은 문제는 발포막 내에서 부상이 어떻게 시작되는지에 대한 문제와 관련이 있습니다. 전자 수송 복합체 V, F1F0 ATP 신타제는 염증 중 세포(내피, 백혈구, 상피 포함)에서 유비쿼터스로 발현되는 것으로 알려진 미토콘드리아 단백질이다. 액틴과 튜룰린으로 구성된 세포 골격은 미토콘드리아 단백질뿐만 아니라 많은 세포 모양과 기능 변조를 각각 항구합니다. 우리는 최근에 내인성 분자, 혈관 스타틴, 침묵 호중구 모집, 활성화 및 리포 폴리사카라이드 (LPS)에 의해 ATP synthase의 봉쇄가 폐 염증6을유도하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 생화학적(ATP synthase)과 면역(TLR4) 메커니즘은 폐 염증 시 폐포 장벽을 조절할 수 있다.
오존(O3)에 노출되면 환경 오염물질, 폐 기능 저하, 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키고,O3 노출의 짧은 저수준은 근기 심폐질환7,8,9,10,11,12, 13,14의기초심률을 가진 이들의 사망률 위험을 증가시킨다. 따라서,O3의 생리학적관련 농도에 노출되면 염증7,8의근본적인 기전을 연구하기 위한 ALI의 의미 있는 모델을 제공한다. 우리 실험실은 최근 저용량 O3 유도 ALI 15의 뮤린 모델을설립했다. 낮은O3 농도에 대한 투여량 및 시간 반응을 수행한 후, LPS 모델과 유사한 폐 ATP 신타제 복합 V 서브유닛 β(ATPβ) 및 혈관스타틴 발현에 의해 표시되는 급성 폐 손상을 유도하는 것을 관찰하였다. 인트라바이탈 폐 이미징은 폐 손상을 나타내는 폐포액소균의 해체를 밝혀, 및 폐포 중격 반응성 산소 종(ROS) 수준(기준세포 신호의 변색을 나타내는) 및 미토콘드리아 막 전위(급성 세포 사멸을 나타내는)의 절제는 이질성 폐 18FDG 보존16,중성구 모집 및 사이토메16-16, 중성구 모집 및 사이토메킨 방출과 상관관계가 있는 0.05 ppm O315에 2시간 노출 후 우리의 최근 연구에서 테이크 홈 메시지는 O3 인간의 노출에 대 한 8 시간 (하루) 허용 된 한계 아래 농도에 노출 될 때 기하 급수적으로 높은 독성을 생산. 중요하게도, 이러한 하위 임상O3 노출이 세균성 내독소(17)에 의한 TLR4 매개메커니즘을 조절할 수 있는지에 대해서는 명확한 이해가 존재하지 않는다. 따라서, 우리는 이중 히트 O3 및 LPS 노출 모델을 공부하고 면역 및 비 면역 세포 적응을 관찰했다.
우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지 폐포 라베지 액체의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다 (즉,, BAL) 폐포 공간을 샘플링하는, 폐 혈관 난간 (즉, LVP)은 폐 혈관 과 폐 막증을 시료하고 폐경 벽이 손상된 경우 폐 극저섹션을 남기고, 상주 피렌자피 및 부착 된 leuks좌를 들여다 보는 , 순환백혈구체와 흉골 및 대퇴골골수를 나타내는 말초 혈액은 각각 염증 중 조혈 세포 동원의 근해 및 말단 부위를 시료하는 양상동맥 및 대퇴골 골수와 이복된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
연구 디자인은 서스 캐처 원 대학의 동물 연구 윤리 위원회에 의해 승인되었으며 인도적 인 동물 사용을위한 동물 관리 지침에 대한 캐나다 위원회에 준수되었습니다. 6-8주 된 남성 C57BL/6J 마우스가 조달되었다. 참고: 예정된 종점 전에 심한 혼수, 호흡 곤란 또는 심각한 고통의 다른 징후를 개발하는 동물을 안락사시하십시오.
참고 : 다음을 준비 : 27-18 G 바늘 무딘 (마우스 기관 직경에 따라 달라집니다), 무딘 바늘에 맞게 적절하게 크기의 PE 튜브 (모든 마우스에 대한 PE 캐뉼라만들기), 캐뉼라, 날카로운 가위 2개, 무딘 집게 2개(소형), 날카로운 집게(소형), 31mL 주사기, 라벨이 부착된 미세푸지 튜브(BAL, 혈액, 혈관 및 골수 난투 수집용) 및 라벨이 부착된 바이알(조직 고정용), 티슈 수집용 샘플 백/냉동, 정육점면의 면실 롤(적절한 결합체로 절단). 실험에 사용되는 모든 화학 물질은 재료 표에표시됩니다.
1. 오존과 LPS 는 뮤린 폐 부상의 유도에 대한 노출
- 오존 노출
- 사용자 지정 O3 유도 상자를 준비합니다. 마우스 사료, 물병, 농축 장난감, 깨끗한 침구를 순서대로 추가하고 마우스의 주거 환경을 모방하십시오.
참고: 이 단계는 마우스가 사용자 지정 유도 상자에 보관할 때 음식과 물에 무료로 접근할 수 있도록 보장하고 과도한 스트레스를 완화하는 데 도움이 됩니다. - O3 교정기/발전기 "ON"(입구 포트쪽으로 배치)을 전환하여 손 전(노출 15분 전) UV 램프를 안정화하고 인라인 O3 모니터와 연결합니다.
참고: O3 모니터는 일정한 챔버 공기 온도(72 ±3°F) 및 상대 습도(50±15%)에서 콘센트에서 샘플링한 바와 같이 평균 0.05 ppm을 읽어야 합니다. - O3 노출의 경우 마우스를 사용자 지정 유도 상자에 부드럽게 배치하고 마우스를 0.05 ppm O3에 지속적으로 노출시 2h.
- 사용자 지정 O3 유도 상자를 준비합니다. 마우스 사료, 물병, 농축 장난감, 깨끗한 침구를 순서대로 추가하고 마우스의 주거 환경을 모방하십시오.
- 마취 및 비강 내 LPS 관리
- 케타민과 자일라진에 대해 10 mg/mL 주식을 별도로 준비합니다.
- 케타민 20부분과 자일라진 1부를 섞어 칵테일을 준비한다. 마우스의 무게가 X g인 경우 케타민/자일라진 칵테일을 복막 구멍에 넣습니다. 마우스 1개의 경우 10 mg/mL 케타민 스톡의 10mg/mL 케타민 스톡의 10μL과 자일라진 재고의 50 μL로 구성된 칵테일 1mL를 준비하십시오. 마이크로퍼지 튜브에서 위아래로 파이프를 통해 잘 섞습니다.
참고: 케타민과 자일라진 주식은 일주일 전에 준비할 수 있습니다. - 가벼운 인트라피오날(IP) 케타민(50 mg/kg)/자일라진(1 mg/kg) 믹스(예: 25g 마우스의 경우 0.125mL의 칵테일을 주입)에서 마우스를 마취시한다.
- LPS의 1 mg/mL 용액을 식염수에 준비하고 용액의 50 μL을 파이펫에 채웁니다.
- 손바닥에 등/등쪽 면으로 마우스를 똑바로 잡고 귀를 같은 손으로 잡습니다. 이제 LPS 용액의 50μL(18μL)을 콧구멍 바깥쪽(예: 각 콧구멍에 25 μL 또는 콧구멍에 50 μL) 한 콧구멍에 배치하고 마우스가 LPS 용액을 흡입할 수 있도록 합니다.
- 멸균 식염수 50 μL로 제어 마우스를 주입합니다.
주의: 치명적일 수 있는 주입을 위해 100 μL 이상을 초과하지 마십시오. 부피(예: <50 μL)가 너무 적고 비강 증착의 위험이 있습니다. - LPS 투여 후, 부드럽게 마우스를 내려 놓고, 그들의 위 또는 그들의 머리가 약간 아래쪽으로 기울어진 침구의 마운드에 그들의 등.
참고: 이 방향은비강(19)에서용액의 유지를 연장합니다. - 0, 2, 4, 24, 36 및 72 h에서, 케타민 (200 mg/kg)/자일라진 (4 mg/kg) 믹스 (즉, X는 그램 또는 0.50 mL)의 마우스 무게인 칵테일의 전체 복용량으로 마우스 i.p.를 마취시킵니다.
- 그것은 의식과 오른쪽 반사를 잃을 때까지 마우스를 관찰 (즉, supine 위치에 누워있을 때 다시 설정하지 않습니다). 지금, 마취의 깊이를 마우스를 확인, 호흡을 모니터링하여 (리듬 가슴 여행) 및 심박수, 이는 눈에 띄게 떨어질 한다, 후 1-2 분.
- 다음으로, 페달 반사 신경, 즉, 뒷다리 자릿수 중 하나를 꼬집고 반사로 사지의 후퇴를 관찰하십시오. 마우스가 반응하는 경우 필요에 따라 추가 0.1 mL 주사 이상을 가진 상향 식.
참고: 깊은 마취를 달성하기 위하여는, 특정 긴장 또는 뚱뚱한 마우스는 일반적으로 분포의 더 큰 양을 가지고 있고 이렇게 쉽게 과잉 투약될 수 있다는 것을 명심하십시오, 전체 마취를 위해 허용되지 않는 경우에 충분한 시간이 있는 경우에 (약 10 분 이상이 될 수 있습니다). 따라서, 일부 균주는 마취에 저항할 수 있고 따라서 더 많은 탑업을 요구할 수 있습니다. 이 지식은 다른 긴장과 나이의 마우스를 가진 많은 실제적인 관측 그리고 경험 후에 취득됩니다. O3 및 LPS 노출 직후에 몇 가지 파일럿 실험이 수행되었기 때문에 (즉, 2 시간 시점에서), 우리는 또한 결합 된 O3및 LPS 노출의 즉각적인 효과를 강조하기 위해 그 실험에서 매우 초기 BAL 세포 분석을포함시켰습니다.
2. 샘플 컬렉션
- 수술 트레이에 마우스를 놓습니다. 이제 유체 손실을 피하고 70 % 에탄올 스프레이로 마우스를 살균하기 위해 두 눈에 윤활 눈 연고를 부드럽게 넣습니다.
- 가위로 상부및 하부 피부 막을 통해 작은 상처를 만들어 기관지와 흉부를 노출시킵니다.
- 흉골 바로 아래에 상처를 만들고 마음을 노출하십시오.
- 심장 펑크
- 25G 바늘을 오른쪽 심실로 부착한 25G 바늘을 오른쪽 심실로 넣고 심장 펑크로 혈액을 그립니다.
참고 : 심장구멍을 노출에서 심장 펑크에 시간이 1 분 미만인 경우 혈액은 일반적으로 최소한의 플런저 무승부로 그립니다. 약 0.4-0.5 mL를 수집 한 후, 하나는 나머지 혈액을 수집하기 전에 몇 초 동안 일시 중지해야 할 수 있습니다. 이것은 심장이 오른쪽 심실 챔버로 남아있는 볼륨을 펌핑 할 수 있도록 수행됩니다. 혈액 수집이 끝날 때까지 심장이 펌프를 멈춥니다. - 혈액을 수집하고 추가 처리를 위해 미세 분리 튜브에 보관하십시오.
- 25G 바늘을 오른쪽 심실로 부착한 25G 바늘을 오른쪽 심실로 넣고 심장 펑크로 혈액을 그립니다.
- 기관 절제술
- 핀셋/무딘 집게를 조심스럽게 사용하여 조직 과열된 조직에서 기관 영역을 제거하십시오. 출혈을 피하기 위해 수술 기구보다 장갑을 낀 손을 더 많이 사용하십시오. 혈액이 많이 스며들면 BAL 샘플을 오염시킬 위험이 있습니다. 필요한 경우 면봉을 사용하셔야 하지만 바람직하지는 않습니다. 킴 와이프는 더 나은 대안입니다.
- 이제 흉곽을 잘라 폐를 노출하십시오. 다시 말하지만, 흉골과 늑간 동맥 또는 오름차순 대동맥을 자르지 않도록주의하십시오. 리브 케이지를 통과하는 동안 작은 컷을 만듭니다)
- 회자 스닙 아래에 면 합자를 전달하고 당분간 그대로 둡니다.
- 폐를 가리키는 1/3rd 부분의 적절한 위치에서 기관을 잘라 28 G 기관 캐뉼라에 대한 액세스를 허용합니다.
- 기관체에 28 G PE 캐뉼라(최소 길이 3-5mm 및 삽입용 다산 단종)를 삽입합니다. 분기전에 기관의 끝을 조심한 다음 다시 mm를 당겨 단일 로브만 샘플링하지 않도록 하십시오.
- 단단히, 제자리에 캐뉼라를 개최하는 면 합자 묶는다. 캐뉼라를 붕괴시키지 마십시오.
- 기관지 알베올라 라베이지 (BAL)
- 1 mL 주사기에 PBS의 0.5 mL을 채웁니다.
- 이제 점차적으로 1 mL 주사기의 도움으로 캐뉼라에 PBS의 0.5 mL을 주입합니다.
- PBS를 주입 한 후, 흡입에 저항하지 않는 한 주사기를 흡인.
참고: BAL 유체를 흡입하는 동안 저항이 있는 경우 폐포 또는 기관지 조직의 붕괴를 나타냅니다. 이 경우, 조직의 벽을 형성하는 캐뉼라를 분리하기 위해 작은 캐뉼라에 의해 캐뉼라를 다시 당깁니다. - 라벨이 부착된 미세 분리 튜브에서 흡인된 액체를 수집하고 얼음 위에 놓습니다.
- 동일한 바이알에서 유사한 방식으로 두 개의 라브를 더 수행하십시오(즉, 총 0.5 X 3 = 1.5 mL 라베이지).
- 수집된 BAL 유체의 부피를 측정합니다. 라베지 회수는 90%에 가깝습니다.
- 폐 혈관 난투 (LVP)
- 투심실을 통해 침투하는 동안 폐에서 난파의 백업을 피하기 위해, 흉부와 복부 반쪽 사이의 위치에서 내림차순 흉부 대동맥을 잘라.
- 상처된 대오르타 끝 근처에 구멍을 뚫고 피가 없는 구멍을 뚫는다.
- 다음으로, 오른쪽 심실을 통해 주입 된 방 온도 헤파린화 된 식염수의 0.5 mL로 폐를 퍼펙드합니다.
- 내림차순 흉부 대동맥의 절단 끝에 있는 구멍에서 혈관 분리를 수집하고, 마이크로후지 튜브에 넣고 얼음 위에 놓고 그 부피를 측정합니다.
- 오른쪽 기관지 근위를 기관지(면실)에서 분기로 리게이트합니다.
- 좌측 폐 고정
- 1mL 주사기를 기관 캐뉼라에 연결하면 이전 기관 절개를 통해 삽입할 수 있을 만큼 충분히 길다.
- 최대 0.6mL 마크까지 주사기에 공기를 다시 그립니다.
- 그런 다음, 실온에서 2 %의 파라 포름알데히드로 나머지 주사기 (끝까지)를 채웁니다. 캔눌라에서 공기를 빨지 않고 플런저가 튀어 나올 준비가 되어 있는지 확인하십시오.
- 이제 주사기를 스카치 테이프로 부착하고 최대 20cm 높이의 직립 용기에 부착합니다.
- 부드럽게 플런저를 꺼내 서 고정 된 흐름을 기관쪽으로 합니다. 캐뉼라에 몇 개의 기포가있는 경우, 주사기 위에 플런저를 부드럽게 놓고 유체가 몇 초 후에 흐르기 시작합니다.
- 왼쪽 폐가 20cm 의 물 기둥을 형성하는 20cm 높이에서 5 분동안, 그 자리에서 총 용량으로 팽창하자.
- 이 절차 도중, 이것이 다운스트림 분석에 영향을 미치기 때문에 paraformaldehyde와 접촉에서 적당한 폐 엽을 보호하십시오.
- 접힌 실험실 조직을 배치하여 올바른 폐 엽과 접촉할 수 있는 파라포름알데히드를 흡수하십시오.
주의: 파라포름알데히드는 매우 독성이 있습니다. 따라서 신체의 노출 부위에 흡입하거나 접촉하지 마십시오. 취급 하는 동안 극단적인 주의 하 고 있습니다. - 파라포름알데히드 주입 시간 동안 복부를 살균하십시오.
- 기관에서 올바른 폐 엽을 잘라 내어 어떤 실도 제거하고 즉시 라벨극에 로브를 넣고 폐 호모전의 다운스트림 분자 / 생화학 사이토카인 분석 / RT-PCR / 서부 블롯 분석을위한 액체 질소에 떨어 뜨립니다.
- 모든 결합 조직 또는 흉막에 대 한 왼쪽 폐를 신중 하 게 손질 하 고 4°C에서 24 시간 동안 2% paraformaldehyde에 찍어.
- 표준 포함 프로토콜에 따라 파라핀에 고정 폐를 포함.
주의: 폐 샘플을 과도하게 가열하지 마십시오. - 복부 부분을 잘라 골반 (엉덩이) 뼈에서 피부를 제거합니다.
- 왼쪽과 오른쪽 대퇴골 뼈를 골반 부분에서 분리하고, 얼음 위에 보관된 식염수 채워진 페트리 접시에 담아 낸다.
- 흉골과 대퇴골 골수 흡인 컬렉션
- 실험실 조직을 사용하여 뼈에서 조직과 근육을 청소하십시오.
- 복부 흉곽과 흉골을 얼음 위에 보관한 식염수 채워진 페트리 접시에 넣습니다.
- 흉골과 대퇴골 뼈의 단부및 근위 팁을 잘라냅니다.
- 뼈를 0.5mL의 식염수로 4회 퍼퓨즈하고, 잘 맞는 바늘(24~28G)을 1mL 주사기에 사용하고, 각 뼈의 분획을 필터가 장착하고 얼음 위에 놓는 라벨이 부착된 튜브로 수집합니다.
참고: 바늘 게이지는 동물의 크기마다 다릅니다. 플러시 후, 대퇴골 뼈는 투명하게 나타나야 한다. - 샘플을 채취하면 기관 동물 시설의 지침에 따라 마우스를 비닐 봉지에 넣고 동물 용 시체 냉동고에 넣어 적절한 폐기를하십시오.
3. 샘플 처리
- 총(TLC) 및 차동(DLC) 백혈구 개수
- 원심분리기 말초 혈액, BAL, 폐 혈관 두반및 골수(흉골 및 대퇴골) 시료는 500g에서 10분 동안 샘플링합니다.
- 초월제를 수집하고 플래시를 얼리고 추가 분석이 될 때까지 -80 °C에 저장하십시오.
- PBS의 최소 200 μL에서 세포를 재구성합니다.
- BAL, 혈액, 폐 혈관 배반 및 골수 세포를 혈전계에 계산하여 TLC를 수행합니다.
- 또 다른 9 μL 알리쿼트는 칼신 그린과 적색 에모디듐 호모이머-1의 1 μL 혼합을 혼합하여 세포 내 에스트라아제 활성 및 손상된 BAL 세포(빨간색)로 인해 살아있는(녹색) 세포를 정량화한다.
- 혈액 TLC에 대한 1:10 비율과 폐 혈관 persatsate TLC에 대한 1:2 비율로, 2 % 아세트 산을 LCC를 lyse에 추가합니다.
주의: 농도가 mL당 1x106 세포(골수 샘플에 매우 중요한 경우)가 PBS에서 희석하여 세포 농도를 조정합니다. - DlCs에 대해 아래에 설명된 대로 슬라이드 및 얼룩에 세포 스핀을 준비하는 세포를 원심분리합니다.
참고: 일반적으로 한 슬라이드에서 두 개의 사이토스핀을 준비할 수 있습니다. 그리고 10-15분간의 공기 건조 후 염색 단계를 진행합니다. - 수집된 BAL을 그룹당 3마리의 파일럿 마우스에서 각각 2개의 사이토스핀으로 나누고 활성 산화 인산화(감소된 미토트래커)를 사용하여 액틴/튜룰린 및 미토콘드리아에 얼룩을 두게 한다. NK1.1/Gr1/CX3CR1 및 ATPβ/Ki-67/CD61/혈관스타틴 스테인드 슬라이드에 대해 각각 3마리의 마우스에서 BAL을 두 개의 사이토스핀으로 나눕다. BAL을 3마리 이상의 마우스에서 ATPα/Ly6G 및 CX3CR1/시글렉-F에 얼룩이 두 개 더 넣습니다.
- 기관지알알라 라베이지(BAL) 및 폐 혈관 퍼서막 (LVP) 총 단백질 정량화
- 두 개의 폐 구획(즉, 폐포 중격(interstitial) 및 폐 혈관 배관(혈관) 구획에서 혈관 장벽 또는 상대적 온코틱 압력의 O3 및 LPS 유도 된 혼란을 정량화하기 위해, 수집된 유체의 총 단백질 함량을 측정한다.
- 표준 세제 내성 색소측정 분석을 사용하여 총 단백질 농도에 대한 해동 된 상피 분획을 분석하십시오.
- 기관지알알포라 라베이지(BAL) 및 폐 혈관 두반 (LVP) 케모킨 분석
- 다음으로, 33플렉스 자기 비드 계 면역분석제를 사용하여 BAL 및 폐 혈관 난투(LVP) 주퍼나티제에서 케모키네를 분석한다. 이것은 결합된 노출 후에 확립된 기도/막시티움 대 혈관 chemokine 그라데이션의 방향성에 관하여 알려줄 것입니다.
- Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory 단백질-3 베타), 란테(활성화에 규제됨, 통상T세포 발현 및 분비(CCL5)), CXCL-12/SDF-1알파(기질세포 유래 인자 1), TARC(흉구 및 활성화 조절 케모키네(TARC), TECK(흉구 발현 케모키네(CCL25α) 및 TF).
4. 사이토스핀 염색 및 폐 히스토로지
- 사이토스핀 생화학 적 염색
- 시술 중에 인큐베이션용 화학 물질을 함유하기 위해 소수성 펜으로 사이토스핀을 둘러싸는다.
- PBS에서 사이토스핀을 5분간 재수화합니다.
- 사이토스핀 샘플을 2% 파라포름알데히드로 10분간 수정하고, PBS로 3회 3회 세척하여 각각 5분간 세척합니다.
- 7분 간 얼음 냉기 70% 아세톤으로 페메아빌레를 만들고, PBS로 각각 5분간 3회 세척합니다.
- 액틴 및 튜룰린 또는 감소된 미토트래커에 대한 스테인(알렉사 488 개의 공주 된 남근의 2 μg/50 μL의 혼합으로 배양하고, 알렉사 555 개의 공주 마우스 반 α 튜룰린 또는 감소 된 미토 트래커의 2 μg /μL을 15 분 동안 각각 빨간색으로 표시하십시오.
참고: 마우스 IgG1 등색 조절 항체를 별도의 사이토스핀에서 사용하여 튜룰린 염색 프로토콜을 검증합니다. 설명된 것과 동일한 단계를 수행 4.1.1 ~ 4.1.8, 하지만 등류형 컨트롤에 대 한. - 슬라이드에서 믹스를 부드럽게 팁으로써 얼룩을 제거합니다. DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)와 슬라이드를 5-10 분 동안 스테인 핵으로 배양하십시오.
- 싸이토스핀을 PBS로 3회 세척하고, 페이드 방지 마운팅 미디어로 커버슬립을 하고, 이미징 전에 실온에서 밤새 어두운 시간에 보관하십시오.
- 과학 카메라가 장착된 넓은 수직 현미경으로 이미지를 획득합니다. 이미징 슬라이드시 다양한 형광 채널에 대해 일관된 카메라 노출 시간을 설정합니다.
- 세포스핀 면역 형광 염색:
- 시술 중에 인큐베이션용 화학 물질을 함유하기 위해 소수성 펜으로 사이토스핀을 둘러싸는다. PBS에서 사이토스핀을 5분간 재수화합니다.
- 사이토스핀 샘플을 10분 동안 2% 파라포름알데히드로 배양하여 수정하고, PBS로 3회 3회 세척하여 각각 5분간 세척합니다.
- 2분 동안 0.1% 콜드 트리톤 X-100으로 페메아빌리징, PBS로 3회 3회 세척하여 5분간 세척합니다.
- 다음으로, Fc 블록은 1:50의 Fc 블록 항체 스톡의 희석으로 사이토스핀을 배양하여 15분 동안 차단한다(1차 마우스 항체가 마우스 Fc 항체와 구체적으로 비반응하지 않도록 하기 위해).
- 슬라이드를 팁으로 슬라이드를 제거하고 1% BSA로 변경하고 관심 있는 3가지 주요 항체(다양한 조합의 표 1참조)를 30분 동안 혼합하여 사이토스핀을 배양한다.
참고: 최근연구에서논의된 바와 같이 해당 이차 항체와 병행하여 4.2.1 ~4.2.9단계를 수행하여 동종형 대조군(혼합 마우스 IgG1 및 rat IgG2b kappa 1차 항체를 배양하여 배양하고 항체를 동위형 대조군으로 대체)을 실행해야 한다. - PBS로 3회 3회 세척하여 각각 5분 동안 세척합니다. 시토스핀을 적절히 설계된 이차 항체의 혼합으로 배양하십시오(자세한 내용은 표 1을 참조하십시오).
- 슬라이드에서 믹스를 부드럽게 팁하여 얼룩을 제거하고 DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)로 5-10 분 동안 스테인 핵을 제거하십시오. PBS로 3회 3회 세척하여 각각 5분 동안 세척합니다.
- 페이드 방지 마운팅 미디어가 있는 커버슬립과 이미징 전에 실온에서 밤새 어두운 시간에 보관하십시오.
- 과학 카메라가 장착된 넓은 수직 현미경으로 이미지를 획득합니다. 이미징 슬라이드시 모든 불소 채널에 일관된 카메라 노출 시간을 설정합니다.
- 헤마톡클린과 에오신(H&E) 히스토로지
- 모든 그룹에 대해 폐 저온 섹션에 수정 된 H&E 염색3을 수행하십시오.
- 이미지 분석
- 피지 ImageJ 오픈 소프트웨어(https://imagej.net/Fiji/Downloads)에서 이미지 데이터(.tiff) 파일을 처리하고 분석합니다.
- 필요한 매개 변수(영역, 둘레, 통합 밀도, 셰이프 설명자, Feret의 지름, 원형, 표시 레이블)를 분석 탭 및 설정 측정아래에 기록합니다.
- ROI 관리자를사용하여 "프리핸드 선택" 도구를 사용하여 병합된 이미지 패널에서 약 50-200개의 셀을 수동으로 간략하게 설명합니다. Ctrl+T 명령으로 관심 영역(ROI)을 저장하고 각 셀에 대해 저장된 ROI를 모든 플루오로포어 채널에 복사합니다.
- 다음 프레스 Ctrl+M모든 형광 채널에 대한 사전 설정 매개 변수를 측정 (예를 들어, 405 nm (파란색DAPI 또는 ATPβ), 488 nm (액틴 또는 NK1.1 또는 녹색기-67), 568 nm (튜룰린 또는 Gr1 또는 CD61 빨간색) 및 633 nm (CCR).
- 분석을 나타내는 적절한 이름으로 결과를 .csv 파일로 저장합니다. .csv 파일에서 스프레드시트에 결과를 복사하고 염색된 분자의 형광 강도(FI)(결과 파일의 원시 통합 밀도 컬럼)를 염색 설계에 따라 DAPI 또는 CD61 FI로 분할합니다. 이러한 비율은 "DAPI 또는 CD61 정규화 된 FI 비율"이라고합니다.
- 다음으로, 이러한 정규화된 비율, 원형, 세포 둘레 및 페렛 직경을 플롯하여 결합된 O3 및 LPS 노출 후 세포 크기의 변화를 평가한다.
- 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 수집된 데이터의 정상성을 확인하고 null 가설을 테스트합니다(아래 통계 분석 섹션을 참조하십시오).
- 통계 분석
- 결과를 평균 ± SEM으로 표현합니다. 최소 3마리의 마우스가 그룹당 사용되었다.
- chemokine 데이터 분석을 위해, Benjamini 및 Hoshberg 보정에 따라 거짓 발견 속도에 대 한 단방향 ANOVA p-값을 조정.
- 이러한 데이터가 일반적으로 배포되지 않았기 때문에 이미지 매개 변수, 셀룰러, 페렛 직경, 둘레, DAPI 또는 CD61 정규화된 형광 강도 비율을 Mann-Whitney U 테스트(두 그룹 비교용) 또는 크루스칼 월리스 테스트(여러 그룹 비교용)에 의해 분석합니다.
- 이미징 실험의 나머지 부분에 대 한, 분산의 단방향 분석을 사용 하 여 결과 분석 다음 Sidak의 여러 비교. p-값 <0.05는 중요한 것으로 간주되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
결합된 O3및 LPS 노출은 72h에서 전신 염증 및 골수 동원으로 이끌어 냅니다: 다른 구획에 있는 세포 수는 말초 혈액에 있는 중요한 변경을 밝혔고 대퇴골골총 세포는 결합한 O3 및 LPS 노출에 근거를 두는 때 계산합니다. 결합된O3 및 LPS 노출은 총BAL(도 1A)또는 LVP(도1B)세포 수, 다형성형 세포가 24(도1F,보충도 1),노출 후 36및 72h에서 우세한 세포 유형으로 제시된 어떠한 변화도 유도하지 않았다. 24h BAL 사이토스핀이미지(도 1F)에서다형성 핵세포에 시글렉-f 및 CX3CR1 염색이 없는 점에 유의하시기 바랍니다. BAL 사이토스핀의 트리플 DAPI/CD11b/Gr1 염색은 0h에서 대식세포인 대형 CD11b-및 Gr1 양성 단핵 세포의 존재를 보여주었으며, 이는 더 작은 다형성 핵 세포로 변화하여 4h에서 CD11b 염색이 없는 것으로 나타났다(제1F의 보충제에서볼 수 있듯이). BAL 세포의 대다수는 CD11b와 Gr1 모두에 대해 다형성 및 양성이며, 24시간 포스트노출(보충 도 1)이다.
마우스는 24h(3.3배 대 0, p<0.05, 도 1C)로전신 백혈구를 표시했으며, 72h에서 백혈구는 24h(p<0.01)에 비해 말초 혈액에서 13배 더 낮은 수를 표시하고 4h(p<0.05)에 비해 8.6배 낮은 것으로나타났다. 흉골 골수 세포는 또한 0 h 또는 결합 된 O3 및 LPS 노출 후(도 1D)에비해 변경되지 않았다. 대퇴골골수는 0h(p<0.01, 도 1E)와비교하여 72h에서 28.8배 의 스파이크를 보였으며, 다른 시간점(p<0.01, 도 1E)을나타냈다. LVP의 시각화, 흉골 뿐만 아니라 대골 골수 세포는 또한 주로 다형성 핵 세포에 세포 유형에 변화를 보였다(보충 도 1). 흉골 골수 세포는 세포 외 핵 물질에 의해 입증된 바와 같이 손상의 표시를 보여주었습니다. 대퇴골골은 세포 수와 일치하는 CD11b 및 Gr1 양성세포(보충 도 1)의수가 더 많은 것으로 나타났다.
BAL 총 단백질 함량은 결합 된 O3 및 LPS 노출 후 36 h에서 가장 높았습니다: LVP 및 BAL 구획에서 총 단백질의 정량화는 결합 된 노출로 인한 결과 혈관 및 상피 장벽 손상으로 인한 오존 유도 폐 부종 즉, 혈장 단백질 발산을 상호 연관시키기 위해 수행되었다. BAL 총 단백질은 4h(도2A)에비해 36h(p<0.05)로 4.5배 높았다. 그러나, LVP 단백질은 노출 후 변경되지않았다(도 2B).
결합된O3 및 LPS 노출은 BAL 및 LVP 초월제 모두에서 체모신 멀티플렉스 분해제를 실시하였고 BAL이 아닌 폐 혈관 구획에서 강한 케모키네 그라데이션을 유도합니다. 이 두 구획 간의 상대적 차이는 특정 구획의 우선 유지를 나타냅니다. 호산구 화학요법 제방-2는 LVP 구획에서 4.3배 더 높았으며 0h(p<0.05, 도 3A)에비해 높았다. BAL 구획에서, eotaxin-2는 0h (p<0.01, 도 3B)에비해 4 h에서 3.2 배 낮았다. BAL eotaxin-2 수준은 0h (p<0.01, 그림 3B)에비해 12.6 배 감소로 72 시간까지 지속적으로 감소했습니다. 림프구 화학 요법 IL-2는 0h(p<0.05, 도 3C)에비해 LVP 구획에서 4h에서 10.1배 높았다. BAL 컴파트먼트에서 IL-2는 0h(p<0.05, 도 3D)에비해 36h로 5.0배 낮았다. BAL eotaxin-2 수준은 0h (p<0.05, 그림 3D)에비해 72 h에서 지속적으로 5.9 배 감소를 유지했습니다.
흥미롭게도, 많은 케모키네는 BAL이 아닌 LVP에서 4h로 변경되었습니다. 이러한 chemokines의 대부분은 겸손 한 보였다, 아직 중요 한, LVP 수준에서 증가 4 시간 이후 시간 포인트에 비해. 에오탁신-1 수준은 0h에 비해 노출 후 높지 않았지만, 결합된 노출 후 24(2.7배, p<0.05) 및 72h(5.0배, p<0.01, 도 4A)에비해 4h로 크게 높았다. LVP TNFα의 수준은 36h(p<0.05, 도 4B)에비해 4h에서 3.4배 더 높았다. 유사하게, LVP IFNγ는 72h(p<0.05, 도 4C)에비해 4시간에서 2.9배 높았다. CX3CL1 수준은 또한 결합된 노출 후 24(1.7배, p<0.05), 36(1.6배, p<0.05), 72h(2.2배, p<0.01)에비해 4h로 높았다. CCL27 수준은 결합 노출 후 24(2.7배, p<0.05), 36(3.9배, p<0.05), 72h(2.9배, p<0.05)와 비교했을 때 4h에서 더 높은 수준을보였다(그림 4E).
일부 케모키네는 결합 된 노출 후 4 h에서 LVP에서 강한 존재를 가지고 있었고, 노출 전후BAL에서 변경되지 않았으며, 폐 모세 혈관으로부터 강한 케모키네 반응을 나타낸다. 4시간 에서 IL-16 LVP 수준은 0h(p<0.01), 3.2배(p<0.01), 4.5배 는 36h(p<0.01) 및 4.6배로 인준 후 72h(p<0.01)에 비해 4.6배 증가했다. 4시간 에서, 호중구 케모키네, CXCL5 LVP 수준은 0h(p<0.01), 4.7배, 24h(p<0.01), 2.2배 로 36h(p<0.01) 및 2.7배(p<0.01)에 비해 72h(p<0.01)에 비해 2.7배 증가했다. 4시간 에서 CXCL10 LVP 수준은 0h(p<0.01), 24h(p<0.05), 2.5배 36h(p<0.01) 및 2.7배(p<0.01)에 비해 2.3배증가하였다(4H). 36h에서, 호중구 케모키네, SDF1α LVP 수준은 결합된 노출 후 72h(p<0.01)에 비해 0h(p<0.01), 2.9배(p<0.05), 6.8배(도4I)에비해 4.2배 높았다. 4시간에서, MIP3β LVP 수준은 결합된 노출 후 72h(p<0.05)에 비해 0h(p<0.05), 및 2.3배(도4J)에비해 2.3배 높았다.
결합된 O3및 LPS 노출은 괴사를 유도하고, 세포 세포종, 혈장 막 및 미토콘드리아 무결성을 방해합니다: 구획 백혈구 수및 단백질 내용물들이 LVP chemokine 그라데이션과 상관관계가 아니므로, 이러한 구획에서 얻은 세포를 시각화하는 것이 더 중요해졌습니다. 기준선(0h)의 Ex vivo actin/tubulin 염색은 피질 액틴, 스트레스 섬유뿐만 아니라 라멜리포디아(녹색으로 표시됨, 도 5 왼쪽 상부 패널)와 마이크로튜블러 네트워크(빨간색으로 표시됨, 도 5 왼쪽 상부 패널)의 존재를 나타내는 감소된 미토트래커 염색과 일치하는 활성 미토콘드리아(왼쪽 5개 패널)의 존재를 나타내고 있다. BAL 세포의 95% 이상이 기준선에서 단핵이었다. 4h에서 BAL 세포는 세포외 핵 물질을 보였고, 라멜리포디아가 없는 포심포질 액틴 염색 및 감소된 피질 액틴 얼룩(녹색으로 표시됨, 그림 5 오른쪽 상부 패널),음피투룰 네트워크(빨간색으로 표시됨, 그림 5 오른쪽 상단 패널)는 감소된 미토트래커 염색에 대응하지 않았다(빨간색, 오른쪽 그림 5). DAPI 정규화 된 액틴 형광 강도 분석은 노출 후 4 h에서 액틴 염색의 감소를 나타내는 비율의 3.7 배 감소를 나타냈다 (p<0.01, 도 6A). 유사하게, DAPI 정규화 된 튜룰린 형광 강도도 노출 후 1.5 배 감소 (p<0.01, 도 6B),튜부린 염색의 감소를 나타내는. 라멜리포디아의 손실은 BAL 세포 세포 골격의 순환성의 증가와 함께 분명했다 즉시 즉, 노출 후 2h(p<0.01, 도 6C)및 4h(p<0.05, 도 6C)에서0h(p<0.05) 및 36h(p<0.01)에서 시토스켈레탈 순환이 감소하여 0h(도6C)에비해 노출 후.
최대 24h까지, 결합된 노출로부터의 BAL 세포는 칼세인에 대해 이중 양성(녹색, 도 7)이활성 esterase 활성의 존재를 나타내고, 에티듐 호모이머(적색, 도 7)는일부 세포가 죽었음에도 불구하고 대다수가 부분적으로 손상된 세포를 나타내었다. 36h에서, BAL 세포는 크게 실행 가능했다 (녹색), 다른 전신 구획에서 모집 백혈구에 의해 손상된 세포의 교체를 나타내는(도 7).
BAL 세포의 특정 ATPα 및 Ly6G 염색은 폐포 대식세포뿐만 아니라 호중구에서 단백질의 이산 세포 내 국소화(Movies1 및 2)를노출 후(도7)를나타났다. 결합된 노출은 ATPα(도7,8A)의 DAPI 정규화 형광 강도 비율의 감소와 세포내 Ly6G 단백질 함량의 증가를 주도하였다(도7, 도 8B,영화 1 및 2). ATPα 염색의 감소, 노출 후 24 시간, 낮은 튜룰린과 상관 관계 및 어느 정도 감소 된 미토트래커 얼룩. 우리는 또한 혈소판일 수 있던 노출 후에 anuclear ATPα 양성 세포 체를 관찰했습니다. 그러나, 우리는 우리의 사실 인정을 확인하지 않았습니다. 2h에서, 우리는 0 h에 비해 더 작은 단일 핵 발 세포 (p<0.01 도 8C,p<0.01 도 8D)를관찰했지만 4 h에서, 단핵 세포는 더 컸다 (p<0.01 도 8C,p<0.01 도 8D)0 h에 비해. 24(p<0.01 도 8C,p<0.01 도 8D)및 36h(p<0.01 도 8C,p<0.01 도 8D)에서BAL 세포는 0h에 비해 다형성핵 세포쪽으로의 이동으로 인해 점진적으로 작아졌다.
BAL 세포의 면역페노피핑은 NK1.1, ATP β 및 Ki-67의 일시적인 발현과 O3 및 LPS 노출을 결합한 후 Gr1, CX3CR1 및 혈관스타틴 양성 BAL 세포의 지속적인 발현을 밝혀냈습니다: BAL 사이토스핀의 첫 번째 세트의 면역형 염색은 DAPI 염색으로 정상화되었다. 24h(p<0.05 대 0h, 도9, 10A)에서셀룰러 NK1.1 양성 세포의 증가가있었다. 36h에서, BAL 세포는 낮은 세포 NK1.1 형광 강도 (p<0.01 대 0 및 24 h, 도 9,10A)를가졌다. 세포 Gr1 형광 강도는 24h (p<0.01 대 0 h, 도 9,10B)뿐만아니라 36 h (p<0.01 vs 0 h, 그림 9,10B)에서더 높았다. 유사하게, 세포 CX3CR1 형광 강도는 24h (p<0.01 대 0 h, 도 9,10C)뿐만아니라 36 h (p<0.01 대 0 h, 도 9,10C)에서더 높았다.
또한 발현이 유비쿼터스인 세포 CD61로 정규화되면, 24h(p<0.01 대 0h, 도 9,10D)에서세포 ATPβ 형광 강도의 증가와 세포 ATPβ 형광 강도의 감소를 36h(p<0.01 대 0 및 24h, 그림9)로나타났다. 특히, ATPβ는 36h(도9)에서주변 국소화에 비해 24h로 주로 핵국화를 보였다. 세포증식의 지표인 BAL Ki-67의 세포형광 강도는 0과 36h에 비해 24h(p<0.01 vs 36h, 도 9,10E)로높았다. 상기 수준은 36h(p<0.01, 도 9,10E)에서기준수준 보다 낮았으며, 가장 높은 다형성-핵 CD61 대 기67 발현(36h)으로 인해 기준수준보다낮았다( 그림 9). 마지막으로, BAL 혈관스타틴의 세포형광 강도는 24h와 36h(p<0.01 vs 0h, 도 9,10F)에서일관되게 높았으며, 이는 폐 염증 반응 동안 이러한 메탈로프로틴효소 갈라짐 플라스미노겐 단편의 특정 증가를 나타낸다.
결합된 노출은 광범위한 폐 손상을 일으킵니다: 폐 공술은 결합된 노출이 H&E 염색 극저전서에서 볼 수 있듯이 폐에 장기간 손상을 일으킨다는 것을밝혔다(그림 11). 기관지 및 폐포 중격 손상이 예상되었지만, 노출 후 36h에서 대형 선박의 내피 손상을 관찰할 수 있었습니다(그림 11). 손상된 폐포 격막 및 페리-기관지영역(도 11)에서응집성 내 백혈구, 백혈구 응집체(호중구 포함)의 패치가 있었다.
그림 1: 구획 백혈구 카운트 : A) 기관지 -alveolar 라베이지 (BAL) 총 백혈구 는 0 (즉, 기준선), 4, 24, 36 및 72 h 결합 후 0.05 ppb 오존 (O3)및 50 μg 내 비강 LPS 마우스에 노출. B) 폐 혈관 두막 (LVP) 총 백혈구 농도0 (즉, 기준선), 4, 24, 36 및 72 h 결합 후 0.05 ppb 오존 (O3)및 50 μg 내비소 LPS 마우스에 노출. C) 말초 혈액(PB) 총 백혈구 농도0(즉, 기준선), 4, 24, 36 및 72h를 결합한 후 0.05 ppb ozone (O3)및 50 μg 내비소 LPS 마우스에 노출하였다. D) 흉골골수(BM) 총 백혈구 농도는 0(즉, 기준선), 4, 24, 36 및 72h를 결합한 후 0.05 ppb 오존(O3)및 50 μg 내비소 LPS 마우스에 노출된다. E) 대퇴골골수(BM) 총 백혈구 농도는 0(즉, 기준선), 4, 24, 36 및 72h를 결합한 후 0.05 ppb 오존(O3)및 50 μg 내비소 LPS 를 마우스에 노출하였다. 그래프 A-E의 경우 0h는 파란색으로, 빨간색으로 4시간, 녹색으로 24시간, 보라색은 36시간, 주황색 데이터 포인트에서는 72h로 표시됩니다. * p<0.05 및 ** p<0.01. F) 대표적인 BAL 사이토스핀 슬라이드는 24h 노출에서 단핵 및 다형성 핵 세포를 나타내며 DAPI(파란색), CX3CR1(녹색) 및 시글렉-F(빨간색)로 핵을 염색하였다. CX3CR1과 Siglec-F의 병합은 주황색으로 표시됩니다. 단일 핵 세포의 대부분은 폐포 대식세포의 특징인 Siglec-F에 대해 긍정적입니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 총 단백질 정량화: A) 기관지알포라 라베이지(BAL) 총 단백질 함량 및 B) 폐 혈관 배설물(LVP) 총 단백질 농도는 660nm 단백질 분석(Thermoscientific, IL, US)에 의해 추정되었다. 그래프 A-B의 경우 0h는 파란색으로, 빨간색으로 4시간, 녹색으로 24시간, 보라색은 36시간, 주황색 데이터 포인트에서는 72h로 표시됩니다. * p<0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 폐 에오타신-2 및 IL-2 케모키네 그라데이션: 33개의 케모키네 중, 폐 혈관 두막(LVP) 및 기관지알벨라 라베이지(BAL) 및 유체에서 크게 변경된 2개의 케모킨은 0.05 ppb 오존(O3)및 50 μg 내비소 LPS 노출 후 마우스 A) LVP 에오탁신-2, B) BAL eotaxin-2, C)에서 크게 변화하였다. 데이터는 일방향 아노바에 의해 분석되었고, 복수 변수의 잘못된 발견률에 대한 p-값은 Benjamini 및 Hoshberg 보정에 따라 조정되었습니다. 그래프 A-D의 경우 0h는 파란색으로, 빨간색으로 4시간, 녹색으로 24시간, 보라색은 36시간, 주황색 데이터 포인트에서는 72h로 표시됩니다. 본페로니의 수정 후 쌍별 비교가 분석되었다. * p<0.05를 나타내고, ** p<0.01을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 폐 혈관 두반자 케모키네 농도: 10개 이상의 케모키인 농도가 변경되었지만 폐 혈관 난투(LVP) 구획에서만 변경되었습니다. A) 에오탁신-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α 및 J) MIP3β. 그래프 A-J의 경우 0h는 파란색으로, 빨간색으로 4시간, 녹색으로 24시간, 보라색은 36시간, 주황색 데이터 포인트에서는 72h로 표시됩니다. 본페로니의 수정 후 쌍별 비교가 분석되었다. * p<0.05를 나타내고, ** p<0.01을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 기관지암라 라베지(BAL) 사이토스핀 액틴/튜룰린 및 감소된 미토트래커 얼룩: A에서 0h및 B의 대표적인 이미지 0.05 ppb 오존(O3)과50 μg 내트라나LPS를 결합한 후 4시간. DAPI는 파란색으로 표시되고, 액틴은 녹색으로, 튜룰린은 빨간색으로 표시됩니다. 대표적인 이미지는 A) 0h 및 B로부터 BAL 시토스핀을 0h 와 B로부터 4h로 결합한 후 0.05 ppb 오존(O3)및 50 μg 내트라비소 LPS 를 마우스에 노출시켰다. DAPI는 파란색으로 표시되고 미토트래커가 빨간색으로 줄어듭니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 기관지알벨라 라베이지(BAL) 사이토스켈레탈 단백질 및 순환 분석: ACTin 및 tubulin에 얼룩진 BAL 사이토스핀은 DAPI 정규화된 파라미터 를 위해 분석되었다. A) 액틴 에서 DAPI 형광 강도(FI) 비0 및 4h, B) 튜부닌에서 DAPI 형광 강도(FI) 비0 및 4h 및 C) BAL 세포 세포 세포 세포발생률 0(n=75 세포), 2(n=105 세포), 4(n=66 세포), 24(n=31세포), 36(n=31세포), 36(n=31세포), 세포 36(h=31). O3 및 LPS 노출 직후에 몇 가지 파일럿 실험이 수행되었기 때문에 2시간 시점에서 O3의즉각적인 효과를 강조하기 위해 2h 시간 지점에서 매우 초기 BAL 셀룰러성 분석을 포함시켰습니다. 그래프 A-C의 경우 0h는 파란색으로, 빨간색으로 2시간, 녹색으로 4시간, 보라색은 24시간, 주황색 데이터 포인트에서는 36h로 표시됩니다. * p<0.05를 나타내고, ** p<0.01을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 기관지 알베올라 라베지 (BAL) 세포 내 및 플라즈마 멤브레인 상태 : BAL 세포는 중요한 얼룩, 칼신 (녹색) 및 에티듐 homodimers / EthHD (빨간색)에 대한 염색했다 (빨간색) A에서 대표 상층 이미지 패널에 도시된 바와 같이, B) 24 및 C) 36 h 후 O3 및 LPS 노출 후. 스케일 바 = 200 μm. BAL 사이토스핀은 DAPI(파란색), ATPα(녹색) 및 Ly6G(빨간색)에 대해 면역염색하였다. 대표적인 이미지는 O3 및 LPS 노출 후 A) 0 및 B) 24h의 하부 이미지 패널에 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 기관지알베올라 라베이지(BAL) 미토콘드리아 단백질 ATPα, 리소경 단백질 Ly6G 및 세포 크기 분석: 면역스테인드 BAL 세포는 DAPI를 위해 정규화되어 A를 계산하기 위해 ATPα에서 DAPI 형광성(FI) 강도(FI) 강도 및 B) Ly6G에서 DAPI FI 비율, 0 및 24h OS 후 0 및 24h에서 DAPI FI 비율로 정상화되었다. 면역스테인드 BAL 세포는 또한 O3 및 LPS 노출 후 0, 2, 4, 24 및 36h에서 가장 긴 즉, 페렛 직경 및 B) 둘레를 위해 분석되었다. 그래프 A-D의 경우, 0h(n=119 세포)는 파란색으로 표현되고, 빨간색으로 2h(n=105 세포) 녹색, 4h(n=66 세포) 녹색, 24h(n=309 세포) 보라색및 36h(n=154 세포)로 주황색 데이터 포인트로 표현된다. * p<0.05를 나타내고, ** p<0.01을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 기관지 알베올라 라베지 (BAL) 세포 내 phenotyping : BAL 세포는 DAPI (파란색), NK1.1 (녹색), Gr1 (빨간색) 및 CX3CR1 (마젠타)에 대해 면역 염색했다 (마젠타에서) A에서 대표적인 상부 이미지 패널에 표시된 바와 같이, 0, B) 24 및 C) 36 H후 LpS 및 LPS 3. 스케일 바 = 50 μm. BAL 사이토스핀은 ATPβ(파란색), Ki-67(녹색), CD61(빨간색) 및 혈관스타틴(마젠타)에 대해 면역염색하였다. 대표적인 이미지는 A) 0, B) 24 및 C) O3 및 LPS 노출 후 36h의 하부 이미지 패널에 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 10: 기관지알벨라 라베이지(BAL) 미토콘드리아 단백질 ATPβ, 리소소말 단백질 Gr1, 세포내 CX3CR1 및 혈관 스타틴 분석: 면역스테인드 BAL 세포는 DAPI를 위해 정규화되어 A) NK1.1대 DAPI 형광강도(FI) 비율, B) Gr1 ~ DAPI FI 비 및 C) CX3CR1 ~ DAPI FI 비 FI, 0, 24 및36 h. 면역스테인드 BAL 세포는 CD61이 A) ATPβ를 대다API 형광 강도(FI) 대 DAPI 형광 강도(FI) 대 DAPI FI 비율 및 B) 혈관스타틴(ANG)에서 DAPI FI 비, O 3 및 LPS 노출 후 0, 24 및 36h로 정규화하였다. 그래프 A-F의 경우 0h(n=21 셀)는 녹색 데이터 포인트에서 빨간색으로 24h(n=796 셀)와 36h(n=2692 셀)로 표현된다. * p<0.05를 나타내고, ** p<0.01을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 폐 헤마톡시린과 에신 (H&E) 공론학. 오존(O3)및 LPS는 O3 및 LPS 노출을 결합한 후 0, 24 및 36h에서 폐 저온절 H&E 공술학을 유도하였다. 폐포 상피 손상 영역은 검은 화살 머리에 의해 단단한 검은 화살과 내피 손상으로 표시됩니다. 노란색 별표(*)는 폐포 중격 부위의 백혈구 패치를 나타냅니다. A = 폐포 공간, B = 기관지, V = 혈관, 스케일 바 = 왼손 이미지 패널용 100 μm, 오른쪽 이미지 패널의 경우 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| S.No. | 1차 항체 | 인비트로겐 이차 항체 |
| 1 | 마우스 안티 NK1.1 IgG2a 카파 (클론 PK136), 인비트로겐 카탈로그 번호 16-5941-82 | 알렉사 488 공액 염소 안티 마우스 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A11002 |
| 2 | 쥐 안티 Ly6G / Ly6C (Gr1) IgG2b 카파 (클론 RB6-8C5), 인비트로겐 카탈로그 번호 53-5931-82 | 알렉사 568 공액 염소 안티 쥐 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A11077 |
| 3 | 토끼 안티 CX3CR1 IgG (RRID 467880), 인비트로겐 카탈로그 번호 14-6093-81 | 알렉사 633 공액 염소 안티 토끼 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A21070 |
| 4 | 마우스 안티 ATP5A1 IgG2b (클론 7H10BD4F9), 인비트로겐 카탈로그 번호 459240 | 알렉사 488 공액 염소 안티 마우스 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A11002 |
| 5 | 쥐 안티 Ly6G IgG2a 카파 (클론 1A8), 인비트로겐 카탈로그 번호 16-9668-82 | 알렉사 568 공액 염소 안티 쥐 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A11077 |
| 6 | 마우스 안티 ATP5β IgG2b (클론 3D5AB1), 써모 피셔 카탈로그 번호. A-21351 | 알렉사 350 공액 염소 안티 마우스 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A11045 |
| 7 | 쥐 안티 기-67 (클론 솔라15) IgG2a 카파, 인비트로겐 카탈로그 번호 14-5698-82 | 알렉사 568 공액 염소 안티 쥐 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A11077 |
| 8 | 아르메니아 햄스터 안티 CD61 (클론 2C9. G2) IgG1 카파, BD 카탈로그 번호 553343 | 알렉사 568 공액 염소 안티 햄스터 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A21112 |
| 9 | 토끼 안티 혈관 스타틴 (마우스 aa 98-116) IgG, Abcam 카탈로그 번호. ab2904 | 알렉사 633 공액 염소 안티 토끼 IgG (H + L), 카탈로그 번호. A21070 |
표 1: 샘플에서 제조된 세포스핀을 얼룩지게 하는 데 사용되는 1차 및 이차 항체 조합.
| 읽기- 아웃 | 발 | LVP | PB | SBM | FBM |
| TLC | * | * | + 24 h; - 36, 72 h | + 72 h | |
| 호중구 | + 24, 36, 72 h | + 24 h에서 | * | + 4, 24, 36, 72 h | + 4, 24, 36, 72 h |
| 단백질 | + 36 h | * | n.d. | n.d. | n.d. |
| 체모키네 프로파일 | - 에오탁신-2, IL-2 앳 4, 24, 36, 72h | + 에오타신-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β 4h; + SDF1α 에서 36 h | n.d. | n.d. | n.d. |
| 셀 크기 | + 4 시간에서; - 24, 36 h | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPα | - 24 h | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| NK1.1/Ki-67 | + 24 h에서 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG | + 24, 36 h | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
표 2: 다른 구획에서 연구의 주요 결과의 포괄적 인 요약. * 변경없음을 나타내지 않고 + 증가를 나타내며 측정 된 매개 변수의 감소를 나타냅니다. BAL은 기관지-폐포라 라베이지 유체를 나타내고, LVP는 폐 혈관 배설물을 나타내고, PB는 말초 혈액을 나타내고, SBM은 흉골 골수를 나타내고 FBM은 대퇴골 골수 구획을 나타낸다.
보충 도 1: Gr1 및 CD11b 면역 염색: DAPI(파란색), Gr1(녹색) 및 CD11b(빨간색) 형광 면역스테인화 된 사이토스핀 슬라이드의 폐 혈관 두반 (LVP), 흉골 골수 (BM) 및 대퇴골 골수 (BM) 구획의 대표적인 이미지는 O3 및 LPS 노출을 결합 한 후 0, 4 및 24 시간에서 구획. 스케일 바 = 50 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 영화 1 0h 시간점(즉, 기준선)에서 BAL 대식세포의 3차원 렌더링 부피, 핵(파란색으로 표시) 및 ATPα(녹색으로 표시됨) 및 Ly6G(빨간색으로 도시됨)에 대한 면역스테인드를 표시한다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 영화 2: O3 및 LPS 노출을 결합한 후 24시간 지점에서 BAL 대식세포의 3차원 렌더링 부피가 결합되어 핵(파란색으로 표시됨)을 나타내고 ATPα(녹색으로 표시됨) 및 Ly6G(빨간색으로 도시됨)에 대한 면역스테인드를 나타낸다. 단편화된 세포뿐만 아니라 비핵화 ATPα 양성체의 존재를 주목한다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
현재 연구에서 제시된 방법은 폐 염증 도중 다중 세포 사건을 공부하기 위하여 다중 구획 분석의 유용성을 강조합니다. 표 2의결과를 요약했습니다. 우리와 많은 실험실은 광범위하게 폐 호중구의 급속한 모집에 의해 표시되는 비강 LPS 주입에 뮤린 반응을 연구했습니다, 이는 6-24 시간 사이 피크, 해상도차기. 그리고 최근에는 서브임상O3(2시간 동안 0.05ppm)만으로도 폐 혈관 구획에 호중구를 분할하여 표시되는 C57BL/6NJ 서브 스트레인15에서상당한 폐 손상을 유도할 수 있으며, 이는 BAL에서 손상된 대식세포및 파편이 관찰된 반면, 따라서O3의염증 가능성을 나타낸다. 그 모형에서 우리는 O3 유도한 폐포 상피 손상및 폐포 대식세포에 의하여 결과된 phagocytosis결과로 폐포 구획에 있는 호중구의 부재를 관찰했습니다. 우리는 O3 모형에 있는 세포외 DNA 및 파편을 관찰했을 뿐 아니라, BAL 대식세포는 높은 IL-16 수준과 상관관계가 있는 이형성이었습니다, 일반적으로 정지호성 구형에 의해 풀어 놓인 경보인. 따라서, 이러한 하위 임상 O3 수준이 그렇지 않으면 견고한 C57BL/6J 서브 스트레인에서 면역 반응에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 이해하는 것이 중요하다, supra-생리O3 레벨21로언급된 바와 같이. 우리는 폐뿐만 아니라 전신 구획에서 O3 및 내비강 내 항내 유도 호중구 모집을 결합 관찰, BAL에서 손상된 호중구의 존재에 의해 표시, 폐 혈관 투과, 흉골과 대퇴골 골수 구획은 24, 36 및 72 h에서 높은 남아 4 h에서 시작. 세포 손상은 피질 액틴과 라멜리포디아의 손실로 나타내고 BAL 백혈구의 세포 크기가 증가했습니다. BAL 구획에서 분석된 호중구는, 마이크로튜블러, ATP 신타제 복합 V 서브유닛 α(ATPα) 및 활성 미토콘드리아 스테인에 대한 양성 반응성을 현저히 감소시켰습니다. 폐는 ATP 시체 복합 V 서브유닛 β(ATPβ)뿐만 아니라 ATPβ 리간드, 혈관스타틴(표2)의발현을 조절함으로써 이러한 결합된 노출에 적응한다.
염증 을 연구의 중요 한 측면 은 케모키네 그라데이션과 함께 세포 괴사를 이해 하는. 말초 혈액과 대퇴골 골수 구획을 제외하고는 전체 백혈구 수가 다르지 않다는 점에 유의하는 것이 흥미로웠습니다. 이러한 관찰은 세포 세포 골격 패턴, 크기 및 면역 페노티핑을 조사하도록 이끌었습니다. 우리는 세포 손상을 나타내는 BAL 세포에서 라멜리아와 활성 미토콘드리아의 손실을 관찰했다. 피질 액틴 조직은 세포 간 신호 및 그로 인한 장벽 특성의 필수적인 기능입니다. 사이토셀레탈 해체는 괴사를 평가하는 것만큼 분명하지 않을 때 세포 손상의 좋은 마커입니다. 36h에서도 BAL 세포는 에디듐 호모이머 염색에 의해 표시된 플라즈마 멤브레인을 손상시켰습니다. 결합 된 노출 직후, BAL의 호중구는 Gr1 양성뿐만 아니라 CD11b에 대한 본질적으로 부정적인 염색을 보여 주었으며, 이는 앞가장자리로 국한되고 폐포 중격 크롤링22의보조보조를 특징으로합니다. 따라서, 결합된 노출은 CD11b 단백질이 없는 비정형 호중구의 축적으로 이끌어 내게 한다. LPS는 CD11b의 하향 조절을 유도하지 않습니다. 따라서, 이 특징은 호중구에O3 유도손상의 결과일 가능성이 있다.
BAL 세포는 0h(표2)에비해 24h에서 더 높은 NK1.1, Ki-67 및 ATPβ 염색을 가진 독특한 단백질 시그니처를 가졌다. BAL 세포는 0h(표2)에비해 24시간 뿐만 아니라 36h에서 Gr1, CX3CR1 및 혈관스타틴의 발현이 더 높았다. 이러한 사실 인정은 발에서 점진적으로 더 많은 Gr1 양성 호중구의 존재에 의해 확증되었다, 에서 24 및 36 h, 노출 후(표 2). NK1.1, CX3CR1 및 Gr1 양성 세포의 존재는 24h에서 BAL에서 단핵 및 다형성 핵 세포의 모집을 나타냅니다. 마커로 기-67과 혈관 스타틴의 포함은 BAL에서 각각 증식 대 항 혈관 신생 군대에 대해 알려주었습니다. 따라서, 결합된 O3 및 LPS 노출은 호중구성 침투로 인한 항 혈관신생 밀리유에 선행될 아마 대식세포의 증식으로 이끌어 냅니다. ATPβ 염색의 일시적인 증가는 24h에서 BAL 백혈구의 증가된 생존을 향한 중요한 적응을 나타낼 수 있다. ATPβ는 혈관 스타틴에 결합하고 장기간 생존6,23을억제 할 수 있음을 주목해야하며, 이는 실제로 36 h 포스트 노출에서 낮은 Ki-67 지수에 반영됩니다.
BAL 단백질은 36h에서 가장 높았고 다른 시간 포인트는 아니지만 폐 혈관 배반은 노출 전후의 단백질 농도에 어떤 변화도 나타내지 않았습니다. 혈관 구획이 영향을 받지 않았을 가능성이 있지만, 이는 메타오닌, 히스티딘 및 시스테인과 같은 전자가 풍부한 아미노산의 산화로 인해 가장 가능성이 혼동될 가능성이 높으며,O3 유도 된 자유 라디칼 및 그 결과 계면 활성제 단백질 (SP-A, SP-B) 분해뿐만 아니라 혈관 누출24,25, 25. BAL IgM, BAL 계면활성제 단백질, BAL 알부민 또는 염료 사치(에반스 블루 또는 플루오레세인 이소 티오카네이트(FITC) 디엑스트라엔을 사용하여 상피 및 내피성 무결성을 평가하는 대체 방법이다.
흥미롭게도, 폐 혈관 난투 농도는 에오탁신-2 및 IL-2의 4h 시간 시점에서 급성 으로 제기되었다. BAL eotaxin-2 및 IL-2 수준은 폐막 공간에 있는 저하 또는 폐 혈관에 있는 함정을 나타내는 노출 후에 현저하게 감소되었습니다. 폐 혈관 난투막에서 분석된 더 많은 케모키네는 호산구 케모키네(eotaxin-1), TNFα, IFNγ, 림프절 유래 단핵 세포 케모키네스 (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), 상피 유래 호중구 케모키네 (CXCL5), 및 호중구(27)의이차 괴사 후 방출 된 경보인 (IL-16)은 4h에서만 방출된다. 36h에서, 골수는 범류세포 케모키네,SDF1α(28)에서,폐 혈관 난투에서 더 높았다. 골수 유래 SDF1α 농도는 CD11b 및 Gr1 양성 세포가 노출 후 24 및 36h에서 풍부하다는 세포학 연구 결과와 상관관계가 있다. 따라서, 케모키네 및 세포학적 프로파일은 골수 구획으로부터 의한 백혈구 동원을 반영한다(표 2).
우리의 동물 모델 및 연구 결과는 도시 환경에서 살아있는 존재가 이러한 하위 임상 O3 및 전염성 요원8에노출 될 가능성이 있는 실제 상황을 염두에 두는 데 매우 중요합니다. 우리의 뮤린 모델은 COVID-19 감염(29)의경우와 같이 침습적 세포 죽음과 감염의 폐 및 폐 폐 메커니즘을 연구하기위한 레벨 2 봉쇄 실험실에서 재현 할 수있는 쉽게 접근 할 수있는 프로토 타입역할을합니다. 향후 연구는 장기적인 세포 적응을 조사하기 위해 수리 또는 후기 단계 후속뿐만 아니라 만성 노출을 시각화하는 데 지시되어야합니다. 따라서, 살아있는기관(15) 및동물(16,30,31) 이미징 기술을 포함하는 포괄적인 폐 염증 연구를 위해, 현재 종점 연구 설계는 결합된 저용량 O 3(세포사멸) 및 LPS(면역 자극)에 대한 숙주 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있고, 따라서 급성 폐 손상의 메커니즘을 해독할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이나 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 대통령의 NSERC 보조금과 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터의 스타트업 기금에 의해 지원됩니다. 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터는 혁신 서스캐처원의 지원을 받고 있습니다. 형광 화상 진찰은 NSERC에 의해 투자되는 WCVM 화상 진찰 센터에서 수행되었습니다. 제시카 브로코스(MSc 학생)와 만프리트 카우르(MSc Student)는 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터의 스타트업 기금으로 지원받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K.
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al.
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
