オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化
Summary
オゾンと細菌性内毒素を組み合わせたマウスは、好中球を含む広域細胞死を示す。細胞骨格ラメリポディアの破壊、気管支-肺胞洗浄における複雑なV ATPシンターゼサブユニットβおよびアンジオスタチンの細胞発現の増加、肺免疫応答の抑制および好中球の遅れなど細胞適応を観察した。
Abstract
肺は、無菌(粒子または反応性毒素)および感染性(細菌、ウイルスまたは真菌)の炎症状態の形で直接的および間接的な侮辱に絶えず直面している。圧倒的な宿主応答は、呼吸の低下および急性肺損傷をもたらし、これは病理論理的宿主免疫、凝固および組織改修応答の結果として肺好中球の募集によって特徴付けられる。マウス肺の細胞適応を可視化し定量化する敏感な顕微鏡的方法は、低用量(0.05ppm)オゾンに応答して、細菌リポ多糖と組み合わせた強力な環境汚染物質、TLR4アゴニストであり、宿主の炎症および修復メカニズムを理解するために極めて重要である。各種肺および全身体区画、すなわち気管支肺胞洗浄液、肺血管透過液、左肺凍結切片、および胸骨骨髄透過液の包括的な蛍光顕微鏡分析について述べています。我々は、肺胞マクロファージ、好中球、肺の核組織、ならびに骨髄細胞と、分析された区画内の離散ケモカイン勾配によって特徴付けられた遅延(最大36〜72時間)の免疫応答と相関する骨髄細胞の損傷を示す。また、肺外細胞マトリックスおよび細胞細胞細胞骨格相互作用(アクチン、チューブリン)、ミトコンドリアおよび活性酸素種、抗凝固性プラスミノーゲン、抗血管新生ペプチド断片アンジオスタチン、ミトコンドリアATPシンターゼ複合体Vサブユニット、αおよびβを提示する。これらの代理マーカーは、 生体外 細胞ベースのアッセイおよび 生体内 動物イメージング技術(生体内顕微鏡など)を十分に補えば、新しい免疫調節剤に対する肺応答を理解するための重要な情報を提供できる。
Introduction
急性肺損傷(ALI)は、血液凝固、線維性および自然免疫系の同時活性化によって特徴付けされる感染性または他の有害な刺激に対する肺の重要な病理学的応答である1。好中球は、トール様受容体(TLR)ファミリー2、3、4を介して微生物と細胞内損傷パターンを速やかに感知する。好中球は、前形サイトカインおよび細胞傷害性顆粒内容物を放出し、その後、副次組織損傷を引き起こす可能性がある。続く歯槽の損傷は、アデノシン三リン酸(ATP)5などの分子の放出をもたらす二次細胞死と結婚し、免疫調節不全の悪循環に陥る。
ALIの理解における未解決の問題は、歯槽膜内で傷害がどのように開始されるかという問題に関連する。電子輸送複合体V、F1F0 ATP合成酵素は、炎症時に細胞(内皮、白血球、上皮を含む)の細胞上で、遍在的に発現することが知られているミトコンドリアタンパク質である。アクチンとチューブリンで構成される細胞骨格は、ミトコンドリアタンパク質と同様に、多くの細胞形状および機能調節を収容する。我々は最近、内因性分子によるATP合成酵素の遮断が、アンジオスタチン、無音性好中球の募集、活性化およびリポ多糖(LPS)が肺炎症を誘発したことを示した。したがって、生化学的(ATP合成酵素)と免疫(TLR4)の両方のメカニズムは、肺の炎症時に歯槽バリアを調節する可能性があります。
オゾン(O3)への暴露は、環境汚染物質、肺機能の低下、肺機能の低下、肺感染症への感受性の増大、およびO3曝露の短い低レベルは、基礎となる心呼吸状態7、8、9、10、11、12、13、14の死亡率のリスクを高める。従って、O3の生理学的に関連する濃度への暴露は、炎症7、8の基本的なメカニズムを研究するALIの有意義なモデルを提供する。私たちの研究室は最近、低用量O3誘導ALI15のマウスモデルを確立しました。低O3濃度に対して用量および時間応答を行った後、我々は、2時間の0.05 ppmO3への曝露が、LPSモデルと同様の肺ATPシンターゼ複合体Vサブユニットβ(ATPβ)およびアンジオスタチン発現によって特徴付けられた急性肺損傷を誘発することを観察した。インビタル肺イメージングは肺の損傷を示す肺胞アクチンマイクロフィラメントの解体を明らかにした、 そして、肺胞中隔反応性酸素種(ROS)レベルのアブレーション(ベースライン細胞シグナル伝達の省略を示す)およびミトコンドリア膜電位(急性細胞死を示す)を2時間暴露した後、異種肺18FDG保持16と相関した0.05 ppm O315に曝露し、好中球のリクルートおよびサイトカイン放出、最もILDF-16と16の放出を伴わない。私たちの最近の研究からの持ち帰りメッセージは、O3が人間の暴露のために8時間(1日あたり)にわたって0.063 ppmの許容限界を下回る濃度で暴露されると指数関数的に高い毒性を生み出すということです。重要なことに、これらのサブ臨床O3曝露が細菌内毒素17などによってTLR4媒介機構を調節できるかどうかについては、明確な理解は存在しない。そこで、デュアルヒットO3およびLPS曝露モデルを研究し、免疫および非免疫細胞適応を観察した。
各種肺および全身体区画、すなわち気管支肺胞洗浄液(すなわち、 BAL)肺胞空間をサンプリングするBAL)、肺血管穿孔体(すなわち、LVP)が肺血管構造および肺胞中隔間質を凝視し、内皮障壁が損なわれた場合に、左肺凍結管、ラビン肺組織に残された常駐の腹膜および付着性白血球を調べた。、循環性白血球を表す末梢血および胸骨および大腿骨骨髄は、それぞれ炎症時に造血細胞動員の近位および遠位部位をサンプリングする。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在の研究で提示された方法は、肺の炎症中に複数の細胞事象を研究するための複数のコンパートメント分析の有用性を強調する。我々は、その結果を表2にまとめた。私たちおよび多くの研究室は、肺中球の急速な採用によって特徴付けられた鼻内LPS点眼に対するマウス応答を広範囲に研究してきました。そして最近、サブ臨床O3(2時間0.05ppm)単独で、肺血管区画内の好?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
実施された研究は、大統領のNSERC助成金とシルビア・フェドーク・カナダ原子力イノベーションセンターからのスタートアップ資金によって資金提供されています。シルビア・フェドールク・カナダ原子力イノベーションセンターは、イノベーション・サスカチュワン州が資金を提供しています。蛍光イメージングは、NSERCが資金を提供するWCVMイメージングセンターで行われました。ジェシカ・ブロコス(MScスチューデント)とマンプリート・カウル(MScスチューデント)は、シルビア・フェドーク・カナディアン・イノベーション・センターのスタートアップ資金によって資金提供されました。
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
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