Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute

Summary

Questo metodo introduce una semplice tecnica per il rilevamento del rilascio endogeno di monoammina utilizzando fette di cervello acute. La configurazione utilizza una piastra a 48 pozzetti contenente un supporto in tessuto per il rilascio di monoammina. La monoammina rilasciata viene analizzata mediante HPLC accoppiato con il rilevamento elettrochimico. Inoltre, questa tecnica fornisce un metodo di screening per la scoperta di farmaci.

Abstract

I neurotrasmettitori monoamminici sono associati a numerosi disturbi neurologici e psichiatrici. Modelli animali di tali condizioni hanno mostrato alterazioni nel rilascio di neurotrasmettitori monoamminici e nelle dinamiche di assorbimento. Metodi tecnicamente complessi come l’elettrofisiologia, la voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV), l’imaging, la microdialisi in vivo, l’optogenetica o l’uso della radioattività sono necessari per studiare la funzione della monoammina. Il metodo qui presentato è un approccio ottimizzato in due fasi per rilevare il rilascio di monoammina in fette cerebrali acute utilizzando una piastra a 48 pozzetti contenente supporti tissutali per esaminare il rilascio di monoammina e cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con rilevamento elettrochimico (HPLC-ECD) per la misurazione del rilascio di monoammina. In breve, le sezioni cerebrali di ratto contenenti regioni di interesse, tra cui la corteccia prefrontale, l’ippocampo e lo striato dorsale sono state ottenute utilizzando un’affettatrice di tessuto o vibratoma. Queste regioni di interesse sono state sezionate da tutto il cervello e incubate in un tampone fisiologico ossigenato. La vitalità è stata esaminata durante il corso del tempo sperimentale, mediante il test 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). Le regioni cerebrali acutamente sezionate sono state incubate in diverse condizioni farmacologiche che sono note per indurre il rilascio di monoammina attraverso il trasportatore (anfetamina) o attraverso l’attivazione del rilascio vescicolare esocitotico (KCl). Dopo l’incubazione, i prodotti rilasciati nel surnatante sono stati raccolti e analizzati attraverso un sistema HPLC-ECD. Qui, il rilascio basale di monoammina viene rilevato dall’HPLC da fette di cervello acute. Questi dati supportano i precedenti risultati in vivo e in vitro che mostrano che AMPH e KCl inducono il rilascio di monoammina. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i meccanismi associati al rilascio dipendente dal trasportatore di monoammine e offre l’opportunità di esaminare i composti che influenzano il rilascio di monoammina in modo rapido e a basso costo.

Introduction

Una pletora di malattie neurologiche e psichiatriche sono associate a disregolazione o insufficiente mantenimento del neurotrasmettitore monoamminico (dopamina [DA], serotonina [5-HT], noradrenalina [NE]) omeostasi1,2,3. Queste condizioni includono, ma non sono limitate a, ^{depressione1,2}, ^{schizofrenia2}, ^ansia2, ^dipendenza4, ^{menopausa5,6,7}, ^dolore8 e morbo di ^Parkinson3. Ad esempio, diversi modelli di menopausa su ratti hanno dimostrato che la disregolazione o la riduzione delle monoammine all’interno dell’ippocampo, della corteccia prefrontale e dello striato può essere associata sia alla depressione che al declino cognitivo, che si osserva nelle donne in menopausa. La disregolazione delle monoammine in questi modelli è stata ampiamente esaminata utilizzando HPLC-ECD, sebbene gli studi non abbiano discriminato tra il contenuto di neurotrasmettitori misurato rispetto al rilascio di neurotrasmettitori5,6,7. Le monoammine vengono rilasciate classicamente nello spazio extracellulare attraverso il rilascio vescicolare ^Ca2+–^dipendente9 e vengono riciclate attraverso il rispettivo sistema di ricaptazione della membrana plasmatica (trasportatore della dopamina, DAT; trasportatore della serotonina, SERT; trasportatore della noradrenalina, NET)^10,11. Al contrario, i dati suggeriscono che questi trasportatori sono in grado di rilasciare o efflussare monoammine, poiché le droghe d’abuso come l’anfetamina (AMPH) e la 3,4-metilendiossimetanfetamina (MDMA) sono note per rilasciare DA e 5-HT, rispettivamente attraverso i loro sistemi di trasporto12,13,14,15,16,17 . Pertanto, una corretta comprensione meccanicistica delle dinamiche di rilascio delle monoammine è cruciale per lo sviluppo di farmacoterapie specifiche e mirate.

Una vasta gamma di tecniche è stata impiegata per studiare il rilascio di monoammine come la voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV)¹⁸, la microdialisi in ^vivo13, l’imaging19, la preincubazione con monoammine radiomarcate20, l’optogenetica e, più recentemente, i sensori fluorescenti geneticamente codificati e la fotometria21,22 . FSCV e microdialisi in vivo sono le tecniche primarie utilizzate per studiare il rilascio di monoammine. FSCV è usato per studiare il rilascio esocitotico stimolato di, principalmente, DA in fette cerebrali acute e in ^vivo23. Poiché FSCV utilizza elettrodi per stimolare o evocare il rilascio, la fonte primaria di rilascio di neurotrasmettitori è il rilascio vescicolare ^Ca2+-dipendente18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdialisi in vivo abbinata all’HPLC misura i cambiamenti nei livelli di neurotrasmettitori extracellulari utilizzando una sonda posizionata in un’area cerebrale di ^{interesse13,32}. Simile a FSCV, una delle principali limitazioni alla microdialisi in vivo è la difficoltà nel determinare la fonte di rilascio del neurotrasmettitore: rilascio vescicolare dipendente da ^{Ca2 +} o trasportatore dipendente. Degno di nota, entrambi i metodi consentono la misurazione diretta del rilascio di monoammina. Attraverso il recente progresso dell’optogenetica, la ricerca dimostra il rilevamento del rilascio di 5-HT e DA in un breve lasso di tempo con una squisita specificità del tipo ^{cellulare21,22}. Tuttavia, queste strategie richiedono tecniche e attrezzature complesse e costose e misurano indirettamente il rilascio di monoammina, in particolare attraverso il legame della monoammina ai recettori. Inoltre, le monoammine radiomarcate sono utilizzate anche per lo studio della dinamica delle monoammine. Le monoammine radiomarcate possono essere precaricate in vari sistemi modello come cellule eterologhe che sovraesprimono ogni trasportatore di monoammine20,33,34,35,36,37,38,39,40, neuroni ^primari20, sinaptosomi33,39,41^{, 42}, e fette di cervello ^acute43,44. Tuttavia, la radioattività rappresenta un potenziale danno per lo sperimentatore e gli analiti marcati con trizio potrebbero non ricapitolare fedelmente la dinamica endogena delle ^{monoammine45,46}. I sistemi di superfusione combinati con metodi di rilevamento off-line come HPLC-ECD hanno permesso il rilevamento di monoammine da più fonti tissutali. Qui, questo protocollo fornisce come metodo ottimizzato e a basso costo, semplice e preciso utilizzando fette di cervello acute per misurare direttamente il rilascio basale endogeno e stimolato di monoammina.

Le fette di cervello acute consentono di testare ipotesi meccanicistiche, principalmente in quanto preservano il microambiente anatomico in vivo e mantengono intatte le sinapsi47,48,49,50,51,52. In alcuni studi, fette di cervello acute o tessuto cerebrale tritato sono stati utilizzati in combinazione con una tecnica di superfusione che utilizza KCl per stimolare il rilascio mediato da ^{Ca2+53,54,55,56}. I sistemi di superfusione sono stati fondamentali per far progredire la comprensione del campo dei meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori, comprese le monoammine. Tuttavia, questi sistemi sono relativamente costosi e il numero di camere disponibili per l’analisi dei tessuti varia da 4 a 12. In confronto, il metodo qui presentato è economico, consente la misurazione di 48 campioni di tessuto e può essere raffinato per utilizzare fino a 96 campioni di tessuto. Ogni pozzetto all’interno della piastra a 48 pozzetti contiene supporti per tessuti che utilizzano filtri per separare il prodotto rilasciato dal tessuto e le monoammine rilasciate vengono quindi raccolte e analizzate da HPLC-ECD. È importante sottolineare che questo metodo consente la misurazione simultanea del rilascio di 5-HT, DA e NE da diverse aree cerebrali come la corteccia prefrontale, l’ippocampo e lo striato dorsale dopo il trattamento con agenti farmacologici che modulano il rilascio di monoammine. Pertanto, lo sperimentatore può rispondere a più domande utilizzando un sistema multi-pozzo economico che aumenta il numero di campioni testati e quindi riduce il numero di animali utilizzati.

Protocol

Tutti gli esperimenti, compresa la manipolazione degli animali e la raccolta dei tessuti, sono stati condotti in conformità con l’Università della Florida e il City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), seguendo il protocollo approvato 201508873 (UF) e 1071 (CCNY). Per i reagenti e il tampone, fare riferimento al file supplementare. 1. Preparare fette di cervello di ratto acuto NOTA: In questo esperimento sono stat…

Representative Results

Questa tecnica descrive l’uso di fette di cervello per misurare il rilascio di monoammine endogene utilizzando HPLC con rilevamento elettrochimico basato su una piastra a 48 pozzetti con un supporto tissutale interno. L’impostazione sperimentale è illustrata nella Figura 1 e nella Figura 2. Inizialmente, per garantire la vitalità dei tessuti entro la fine della sperimentazione, è stato eseguito un test MTT (3-(4,5-dimetiltiazo…

Discussion

Le misurazioni del rilascio di monoammine sono state eseguite per anni in un certo numero di sistemi come cellule eterologhe, colture neuronali, sinaptosomi cerebrali, fette di cervello acute ex vivo e animali interi13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<…

Materials

48 Well plate	NA	NA	Assay
Acetonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous	Sigma Aldrich	C1016	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software	Anetc
Citric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Dissection Buffer
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software	Graphpad Software, Inc		Statistical Analysis
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Lysis buffer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, LC-EC system
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid	Sigma Aldrich	A5960	Dissection Buffer
Magnesium Sulfate	Sigma	7487-88-9	KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree	Millipore	C7554	Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Assay
Nanosep	VWR	29300-606	Assay; protein assay
Octanesulfonic acid	Sigma Aldrich	V800010	Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
Potassium Chloride	Sigma	12636	KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	1001655559	KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Dissection Buffer
Sodium Chloride	Sigma	S3014	KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma Aldrich	L3771	Lysis buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Assay / Lysis buffer