Un ensayo basado en placas para la medición de la liberación endógena de monoamina en cortes cerebrales agudos

Summary

Este método introduce una técnica simple para la detección de la liberación endógena de monoamina utilizando cortes cerebrales agudos. La configuración utiliza una placa de 48 pocillos que contiene un soporte de tejido para la liberación de monoamina. La monoamina liberada se analiza mediante HPLC junto con la detección electroquímica. Además, esta técnica proporciona un método de detección para el descubrimiento de fármacos.

Abstract

Los neurotransmisores monoamina están asociados con numerosas dolencias neurológicas y psiquiátricas. Los modelos animales de tales condiciones han mostrado alteraciones en la dinámica de liberación y absorción de neurotransmisores monoamina. Se requieren métodos técnicamente complejos como la electrofisiología, la voltamperometría cíclica de escaneo rápido (FSCV), la obtención de imágenes, la microdiálisis in vivo, la optogenética o el uso de radiactividad para estudiar la función de la monoamina. El método presentado aquí es un enfoque optimizado de dos pasos para detectar la liberación de monoamina en cortes cerebrales agudos utilizando una placa de 48 pocillos que contiene soportes de tejido para examinar la liberación de monoamina, y cromatografía líquida de alto rendimiento junto con detección electroquímica (HPLC-ECD) para la medición de la liberación de monoamina. Brevemente, las secciones cerebrales de rata que contienen regiones de interés, incluida la corteza prefrontal, el hipocampo y el estriado dorsal, se obtuvieron utilizando una cortadora de tejido o vibrátomo. Estas regiones de interés fueron diseccionadas de todo el cerebro e incubadas en un tampón fisiológico oxigenado. La viabilidad se examinó a lo largo del curso de tiempo experimental, mediante un ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Las regiones cerebrales agudamente diseccionadas se incubaron en diferentes condiciones de drogas que se sabe que inducen la liberación de monoamina a través del transportador (anfetamina) o a través de la activación de la liberación vesicular exocitótica (KCl). Después de la incubación, los productos liberados en el sobrenadante se recolectaron y analizaron a través de un sistema HPLC-ECD. Aquí, la liberación basal de monoamina es detectada por HPLC a partir de cortes cerebrales agudos. Estos datos respaldan los resultados previos in vivo e in vitro que muestran que AMPH y KCl inducen la liberación de monoamina. Este método es particularmente útil para estudiar los mecanismos asociados con la liberación dependiente del transportador de monoamina y brinda la oportunidad de detectar compuestos que afectan la liberación de monoamina de una manera rápida y de bajo costo.

Introduction

Una gran cantidad de enfermedades neurológicas y psiquiátricas se asocian con la desregulación o el mantenimiento insuficiente de la homeostasis del neurotransmisor monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norepinefrina [NE])^1,2,3. Estas afecciones incluyen, entre otras, ^{depresión1,2}, ^{esquizofrenia2}, ^ansiedad2, ^adicción4, menopausia5,6,7, ^dolor8 y enfermedad de ^Parkinson3. Por ejemplo, varios modelos de menopausia en ratas han demostrado que la desregulación o reducción de las monoaminas dentro del hipocampo, la corteza prefrontal y el cuerpo estriado puede estar asociada tanto con la depresión como con el deterioro cognitivo, que se observa en mujeres que experimentan la menopausia. La desregulación de las monoaminas en estos modelos ha sido ampliamente examinada utilizando HPLC-ECD, aunque los estudios no discriminaron entre el contenido medido de neurotransmisores versus la liberación de neurotransmisores5,6,7. Las monoaminas se liberan clásicamente en el espacio extracelular a través de la liberación vesicular dependiente de ^Ca2+9, y se reciclan de nuevo a través de su respectivo sistema de recaptación de la membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)^10,11. Por el contrario, los datos sugieren que estos transportadores son capaces de liberar o efluir monoaminas, ya que se sabe que las drogas de abuso como la anfetamina (AMPH) y la 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) liberan DA y 5-HT, respectivamente, a través de sus sistemas de transporte12,13,14,15,16,17 . Por lo tanto, una comprensión mecanicista adecuada de la dinámica de liberación de monoamina es crucial para desarrollar farmacoterapias específicas y específicas.

Se ha empleado una amplia gama de técnicas para estudiar la liberación de monoaminas, como la voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV)¹⁸, la microdiálisis in ^vivo13, la ^imagen19, la preincubación con monoaminas radiomarcadas20, la optogenética y, más recientemente, los sensores fluorescentes y la fotometría codificados ^{genéticamente21,22} . FSCV y la microdiálisis in vivo son las principales técnicas utilizadas para estudiar la liberación de monoamina. FSCV se utiliza para estudiar la liberación exocitótica estimulada de, principalmente, DA en cortes cerebrales agudos e in ^vivo23. Debido a que FSCV utiliza electrodos para estimular o evocar la liberación, la fuente principal de liberación de neurotransmisores es la liberación vesicular dependiente de ^Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdiálisis in vivo junto con la HPLC mide los cambios en los niveles de neurotransmisores extracelulares utilizando una sonda colocada en un área cerebral de ^{interés13,32}. Al igual que el FSCV, una limitación importante de la microdiálisis in vivo es la dificultad para determinar la fuente de liberación de neurotransmisores: liberación vesicular dependiente de ^Ca2+ o dependiente del transportador. Cabe destacar que ambos métodos permiten la medición directa de la liberación de monoamina. A través del reciente avance de la optogenética, la investigación demuestra la detección de la liberación de 5-HT y DA en un corto período de tiempo con una exquisita especificidad de tipo ^celular21,22. Sin embargo, estas estrategias requieren técnicas y equipos complejos y costosos, e indirectamente miden la liberación de monoamina, específicamente a través de la unión de monoamina a los receptores. Además, las monoaminas radiomarcadas también se utilizan para estudiar la dinámica de la monoamina. Las monoaminas radiomarcadas pueden estar precargadas en varios sistemas modelo, como células heterólogas que sobreexpresan cada transportador de monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neuronas ^primarias20, sinaptosomas33,39,41^{, 42}, y cortes cerebrales ^agudos43,44. Sin embargo, la radiactividad supone un daño potencial para el experimentador, y los analitos marcados con tritio pueden no recapitular fielmente la dinámica endógena de la ^{monoamina45,46}. Los sistemas de superfusión combinados con métodos de detección fuera de línea como HPLC-ECD han permitido la detección de monoaminas de múltiples fuentes tisulares. Aquí, este protocolo proporciona como un método optimizado y de bajo costo, simple y preciso que utiliza cortes cerebrales agudos para medir directamente la liberación de monoamina basal endógena y estimulada.

Las rebanadas cerebrales agudas permiten probar hipótesis mecanicistas, principalmente porque preservan el microambiente anatómico in vivo y mantienen intactas las sinapsis47,48,49,50,51,52. En algunos estudios, se han utilizado cortes cerebrales agudos o tejido cerebral picado junto con una técnica de superfusión utilizando KCl para estimular la liberación mediada por ^Ca2+53,54,55,56. Los sistemas de superfusión han sido fundamentales para avanzar en la comprensión del campo de los mecanismos de liberación de neurotransmisores, incluidas las monoaminas. Sin embargo, estos sistemas son relativamente caros, y el número de cámaras disponibles para el análisis de tejidos oscila entre 4 y 12. En comparación, el método presentado aquí es económico, permite la medición de 48 muestras de tejido y puede refinarse para usar hasta 96 muestras de tejido. Cada pozo dentro de la placa de 48 pocillos contiene soportes de tejido que utilizan filtros para separar el producto liberado del tejido, y las monoaminas liberadas son recolectadas y analizadas por HPLC-ECD. Es importante destacar que este método permite la medición simultánea de la liberación de 5-HT, DA y NE de diferentes áreas del cerebro, como la corteza prefrontal, el hipocampo y el estriado dorsal después del tratamiento con agentes farmacológicos que modulan la liberación de monoamina. Por lo tanto, el experimentador puede responder a múltiples preguntas utilizando un sistema económico de múltiples pocillos que aumenta el número de muestras analizadas y, por lo tanto, reduce el número de animales utilizados.

Protocol

Todos los experimentos, incluido el manejo de animales y la recolección de tejidos, se llevaron a cabo de acuerdo con la Universidad de Florida y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del City College of New York, siguiendo el protocolo aprobado 201508873 (UF) y 1071 (CCNY). Para reactivos y tampón, consulte el Archivo complementario. 1. Prepara rebanadas agudas de cerebro de rata NOTA: En este experimento se utilizaron ratas…

Representative Results

Esta técnica describe el uso de rodajas cerebrales para medir la liberación de monoaminas endógenas utilizando HPLC con detección electroquímica basada en una placa de 48 pocillos con un soporte de tejido interno. La configuración experimental se representa en la Figura 1 y la Figura 2. Inicialmente, para asegurar la viabilidad tisular al final de la experimentación, se realizó un ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiaz…

Discussion

Las mediciones de liberación de monoamina se han realizado durante años en varios sistemas como células heterólogas, cultivos neuronales, sinaptosomas cerebrales, cortes cerebrales agudos ex vivo y animales enteros13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 ^</s…

Materials

48 Well plate	NA	NA	Assay
Acetonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous	Sigma Aldrich	C1016	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software	Anetc
Citric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Dissection Buffer
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software	Graphpad Software, Inc		Statistical Analysis
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Lysis buffer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, LC-EC system
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid	Sigma Aldrich	A5960	Dissection Buffer
Magnesium Sulfate	Sigma	7487-88-9	KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree	Millipore	C7554	Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Assay
Nanosep	VWR	29300-606	Assay; protein assay
Octanesulfonic acid	Sigma Aldrich	V800010	Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
Potassium Chloride	Sigma	12636	KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	1001655559	KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Dissection Buffer
Sodium Chloride	Sigma	S3014	KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma Aldrich	L3771	Lysis buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Assay / Lysis buffer