En plattbaserad analys för mätning av endogen monoaminfrisättning i akuta hjärnskivor

Summary

Denna metod introducerar en enkel teknik för detektion av endogen monoaminfrisättning med hjälp av akuta hjärnskivor. Inställningarna använder en 48-brunnsplatta som innehåller en vävnadshållare för monoaminfrisättning. Frisläppt monoamin analyseras av HPLC i kombination med elektrokemisk detektion. Dessutom ger denna teknik en screeningmetod för läkemedelsupptäckt.

Abstract

Monoamin signalsubstanser är associerade med många neurologiska och psykiatriska sjukdomar. Djurmodeller av sådana tillstånd har visat förändringar i monoamin neurotransmittor release och upptag dynamik. Tekniskt komplexa metoder som elektrofysiologi, snabbskanning cyklisk voltammetri (FSCV), avbildning, in vivo mikrodialys, optogenetik eller användning av radioaktivitet krävs för att studera monoaminfunktion. Metoden som presenteras här är en optimerad tvåstegsmetod för att upptäcka monoaminfrisättning i akuta hjärnskivor med hjälp av en 48-välplatta som innehåller vävnadshållare för att undersöka monoaminfrisättning och högpresterande vätskekromatografi i kombination med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) för monoaminfrisättningsmätning. Kortfattat erhölls rått hjärnavsnitt som innehåller regioner av intresse, inklusive prefrontal cortex, hippocampus och dorsal striatum med hjälp av en vävnadsdelare eller vibratom. Dessa regioner av intresse dissekerades från hela hjärnan och inkuberades i en syresatt fysiologisk buffert. Livskraften undersöktes under hela den experimentella tidskursen, med 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analys. De akut dissekerade hjärnregionerna inkuberades i olika läkemedelsförhållanden som är kända för att inducera monoaminfrisättning genom transportören (amfetamin) eller genom aktivering av exocytotisk vesikulär frisättning (KCl). Efter inkubation samlades de frigjorda produkterna i supernatanten in och analyserades genom ett HPLC-ECD-system. Här detekteras basal monoaminfrisättning av HPLC från akuta hjärnskivor. Dessa data stöder tidigare in vivo- och in vitro-resultat som visar att AMPH och KCl inducerar monoaminfrisättning. Denna metod är särskilt användbar för att studera mekanismer i samband med monoamin transportörberoende frisättning och ger en möjlighet att screena föreningar som påverkar monoamin release på ett snabbt och billigt sätt.

Introduction

En mängd neurologiska och psykiatriska sjukdomar är associerade med dysregulation eller otillräckligt underhåll av monoamin signalsubstansen (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homeostas1,2,3. Dessa tillstånd inkluderar, men är inte begränsade till, ^{depression1,2}, ^schizofreni2, ^ångest2, ^missbruk4, ^{klimakteriet5,6,7}, ^smärta8 och Parkinsons ^sjukdom3. Till exempel har flera råttmodeller av klimakteriet visat att dysregulation eller minskning av monoaminer inom hippocampus, prefrontal cortex och striatum kan vara förknippade med både depression och kognitiv nedgång, vilket ses hos kvinnor som upplever klimakteriet. Dysregulation av monoaminer i dessa modeller har undersökts utförligt med hplc-ECD, även om studierna inte diskriminerade mellan uppmätt signalsubstansinnehåll jämfört med neurotransmittor ^release5,6,7. Monoaminer frigörs klassiskt i det extracellulära utrymmet genom ^{Ca2 +}-beroende vesikulär ^{frisättning9}, och återvinns tillbaka genom deras respektive plasmamembranåterupptagssystem (dopamintransportör, DAT; serotonintransportör, SERT; noradrenalintransportör, NET)^10,11. Omvänt tyder data på att dessa transportörer kan frigöra eller effluxmonaminer, eftersom droger av missbruk som amf och 3,4-Metylendioximetamfetamin (MDMA) är kända för att släppa DA respektive 5-HT, genom sina transportsystem12,13,14,15,16,17 . Således är en korrekt mekanistisk förståelse av monoamin release dynamik avgörande för att utveckla specifika och riktade farmakoterapier.

Ett brett spektrum av tekniker har använts för att studera monoaminfrisättning som Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)¹⁸, in vivo microdialys13, ^imaging19, preincubation med radiomärkta monoaminer20, optogenetik och mer nyligen genetiskt kodade fluorescerande sensorer och ^{fotometri21,22} . FSCV och in vivo mikrodialys är de primära teknikerna som används för att studera monoaminfrisättning. FSCV används för att studera stimulerad exocytotisk frisättning av, främst, DA i akuta hjärnskivor och in ^vivo23. Eftersom FSCV använder elektroder för att stimulera eller framkalla frisättning är den primära källan till frisättning av signalsubstansen ^Ca2+-beroende vesikulär frisättning18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialys i kombination med HPLC mäter förändringar i extracellulära signalsubstansnivåer med hjälp av en sond placerad i ett hjärnområde av ^{intresse13,32}. I likhet med FSCV är en stor begränsning av in vivo mikrodialys svårigheten att bestämma källan till neurotransmittor release: ^{Ca2 +} beroende vesikulär frisättning eller transportör beroende. Anmärkningsvärt, båda metoderna möjliggör direkt mätning av monoaminfrisättning. Genom den senaste utvecklingen av optogenetik visar forskning upptäckt av 5-HT och DA-frisättning på kort tid med utsökt celltyps ^{specificitet21,22}. Dessa strategier kräver dock komplexa och kostsamma tekniker och utrustning, och indirekt mäta monoaminfrisättning, särskilt genom monoaminbindning till receptorer. Vidare används radiomärkta monoaminer också för att studera monoamindynamik. Radiomärkta monoaminer kan förinstalleras i olika modellsystem såsom heterologa celler som överuttrycker varje monoamintransportör20,33,34,35,36,37,38,39,40, primära ^nervceller20, synaptosomer33,39,41^{, 42}, och akut ^{hjärnskivor43,44}. Radioaktivitet utgör dock potentiell skada för experimenteraren, och de tritiummärkta analyterna får inte troget rekapitulera endogen ^{monoamindynamik45,46}. Superfusionssystem i kombination med off-line detektionsmetoder såsom HPLC-ECD har gjort det möjligt att detektion av monoaminer från flera vävnadskällor. Här ger detta protokoll som en optimerad och billig, enkel och exakt metod med hjälp av akuta hjärnskivor för att direkt mäta endogen basal och stimulerad monoaminfrisättning.

Akuta hjärnskivor gör det möjligt att testa mekanistiska hypoteser, främst eftersom de bevarar in vivo anatomisk mikromiljö och upprätthåller intakt synapser47,48,49,50,51,52. I några studier har akuta hjärnskivor eller hackad hjärnvävnad använts tillsammans med en superfusionsteknik med KCl för att stimulera ^{Ca2 +} medierad frisättning53,54,55,56. Superfusionssystem har varit avgörande för att främja fältets förståelse av signalsubstansens frisättningsmekanismer, inklusive monoaminer. Dessa system är dock relativt dyra, och antalet kammare som är tillgängliga för vävnadsanalys varierar från 4-12. I jämförelse är metoden som presenteras här billig, tillåter mätning av 48 vävnadsprover och kan förfinas för att använda upp till 96 vävnadsprover. Varje brunn inom 48-brunnsplattan innehåller vävnadshållare som använder filter för att separera den frigjorda produkten från vävnaden, och frigjorda monoaminer samlas sedan in och analyseras av HPLC-ECD. Viktigt är att denna metod möjliggör samtidig mätning av 5-HT, DA och NE frisättning från olika hjärnområden såsom prefrontal cortex, hippocampus och dorsala striatum efter behandling med farmakologiska medel som modulerar monoamin release. Således kan experimenteraren svara på flera frågor med hjälp av ett billigt flerbrunnssystem som ökar antalet testade prover och därmed minskar antalet djur som används.

Protocol

Alla experiment, inklusive djurhantering och vävnadsinsamling, utfördes i enlighet med University of Florida och City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), enligt det godkända protokollet 201508873 (UF) och 1071 (CCNY). För reagenser och buffert, se tilläggsfilen. 1. Förbered akuta råtthjärnskivor OBS: I detta experiment användes vuxna hanråttor (250-350 g). Denna uppsättning är dock funktionell för olik…

Representative Results

Denna teknik beskriver användningen av hjärnan skivor för att mäta frisättningen av endogena monoaminer med HPLC med elektrokemisk detektion baserad i en 48-väl platta med en inre vävnad hållare. Experimentell uppsättning visas i figur 1 och figur 2. Inledningsvis, för att säkerställa vävnad livskraft i slutet av experimentet, utfördes en MTT (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid, en tetrazol) …

Discussion

Monoaminfrisättningsmätningar har utförts i flera år i ett antal system som heterologa celler, neuronala kulturer, hjärnsynaptosomer, ex vivo akuta hjärnskivor och hela djur13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<su…

Materials

48 Well plate	NA	NA	Assay
Acetonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous	Sigma Aldrich	C1016	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software	Anetc
Citric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Dissection Buffer
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software	Graphpad Software, Inc		Statistical Analysis
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Lysis buffer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, LC-EC system
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid	Sigma Aldrich	A5960	Dissection Buffer
Magnesium Sulfate	Sigma	7487-88-9	KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree	Millipore	C7554	Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Assay
Nanosep	VWR	29300-606	Assay; protein assay
Octanesulfonic acid	Sigma Aldrich	V800010	Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
Potassium Chloride	Sigma	12636	KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	1001655559	KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Dissection Buffer
Sodium Chloride	Sigma	S3014	KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma Aldrich	L3771	Lysis buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Assay / Lysis buffer