Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.
Summary
Deze methode kan worden gebruikt om sarcomere verkorting te onderzoeken met behulp van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met fluorescerende sarcomere-eiwitten.
Abstract
Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (PSC-CMs) kunnen worden geproduceerd uit zowel embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellen (ES/iPS). Deze cellen bieden veelbelovende bronnen voor het modelleren van hartaandoeningen. Voor cardiomyopathieën is sarcomere verkorting een van de standaard fysiologische beoordelingen die worden gebruikt met volwassen cardiomyocyten om hun ziektefenotypes te onderzoeken. De beschikbare methoden zijn echter niet geschikt om de contractiliteit van PSC-CMs te beoordelen, aangezien deze cellen onderontwikkelde sarcomen hebben die onzichtbaar zijn onder fasecontrastmicroscopie. Om dit probleem aan te pakken en sarcomere verkorting uit te voeren met PSC-CMs, werden fluorescerende sarcomere-eiwitten en fluorescerende live-imaging gebruikt. Dunne Z-lijnen en een M-lijn bevinden zich aan beide uiteinden en het midden van een sarcomere, respectievelijk. Z-line eiwitten — α-Actinine (ACTN2), Telethonine (TCAP) en actine-geassocieerd LIM eiwit (PDLIM3) — en één M-lijn eiwit — Myomesin-2 (Myom2) — werden getagd met fluorescerende eiwitten. Deze gelabelde eiwitten kunnen worden uitgedrukt uit endogene allelen als knock-ins of uit adeno-geassocieerde virussen (AAV’s). Hier introduceren we de methoden om muis- en menselijke pluripotente stamcellen te differentiëren in cardiomyocyten, om AAV’s te produceren en om live-imaging uit te voeren en te analyseren. We beschrijven ook de methoden voor het produceren van polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels voor een patrooncultuur van PSC-CMs, wat de analyse van sarcomere verkorting met fluorescerende eiwitten vergemakkelijkt. Om de verkorting van sarcomen te beoordelen, werden time-lapse beelden van de kloppende cellen geregistreerd bij een hoge framerate (50-100 frames per seconde) onder elektrische stimulatie (0,5-1 Hz). Om de lengte van sarcomen in de loop van de celcontractie te analyseren, werden de opgenomen time-lapse-beelden onderworpen aan SarcOptiM, een plug-in voor ImageJ / Fiji. Onze strategie biedt een eenvoudig platform voor het onderzoeken van fenotypes van hartaandoeningen in PSC-CMs.
Introduction
Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste oorzaak vanmortaliteit 1 en cardiomyopathie is de derde oorzaak van hartgerelateerde sterfgevallen2. Cardiomyopathie is een collectieve groep ziekten die hartspieren aantasten. De recente ontwikkelingen van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) en de gerichte differentiatie van iPS-cellen naar cardiomyocyten (PSC-CMs) hebben de deur geopend voor het bestuderen van cardiomyocyten met het genoom van de patiënt als een in vitro model van cardiomyopathie. Deze cellen kunnen worden gebruikt om de pathofysiologie van hartziekten te begrijpen, om hun moleculaire mechanismen op te helderen en om verschillende therapeutische kandidaten te testen3. Er is een enorme hoeveelheid interesse, dus patiënt-afgeleide iPS-cellen zijn gegenereerd (bijv. hypertrofische cardiomyopathie [HCM]4,5,aritmogene rechterventrikel cardiomyopathie [ARVC]6, verwijde cardiomyopathie [DCM]7, en mitochondriale-gerelateerde cardiomyopathieën8,9). Omdat een van de kenmerken van cardiomyopathie de disfunctie en verstoring van sarcomen is, is een geldig hulpmiddel nodig dat de sarcomerefunctie uniform meet.
Sarcomere verkorting is de meest gebruikte techniek om de sarcomerefunctie en de contractiliteit van volwassen cardiomyocyten afgeleid van diermodellen en mensen te beoordelen. Om sarcomere verkorting uit te voeren, zijn goed ontwikkelde sarcomen nodig die zichtbaar zijn onder fasecontrast. Psc-CMs gekweekt in vitro display onderontwikkelde en ongeorganiseerde sarcomen en, daarom, zijn niet in staat om te worden gebruikt om goed te meten sarcomere verkorting10. Deze moeilijkheid om de contractiliteit van PSC-CMs goed te beoordelen, belemmert het gebruik ervan als platform om cardiale functies in vitrote beoordelen . Om de contractiliteit van PSC-CMs indirect te beoordelen, zijn atoomkrachtmicroscopie, micro-postarrays, tractiekrachtmicroscopie en impedantiemetingen gebruikt om de effecten van de beweging die door deze cellen op hun omgeving wordt uitgeoefend te meten11,12,13. Meer geavanceerde en minder invasieve videomicroscopie-opnamen van daadwerkelijke cellulaire beweging (bijv. SI8000 van SONY) kunnen worden gebruikt om hun contractiliteit als alternatief te beoordelen, maar deze methode meet niet direct sarcomerebeweging of krachtgeneratiekinetiek14.
Om de beweging van sarcomen in PSC-CMs direct te meten, ontstaan nieuwe benaderingen, zoals fluorescerende tagging voor sarcomere-eiwitten. Lifeact wordt bijvoorbeeld gebruikt om filamenteuze actine (F-actine) te labelen om sarcomerebeweging15,16te meten . Genetisch gemodificeerde iPS-cellen zijn een andere optie voor het taggen van sarcomere-eiwitten (bijv. α-actinine [ACTN2] en Myomesin-2 [MYOM2]) door fluorescerend eiwit17,18,19.
In dit artikel beschrijven we hoe u time-lapse beeldvorming kunt uitvoeren voor het meten van sarcomere verkorting met behulp van Myom2-TagRFP (muis embryonale stam [ES] cellen) en ACTN2-mCherry (menselijke iPS-cellen). We laten ook zien dat een patrooncultuur de uitlijning van sarcomere vergemakkelijkt. Daarnaast beschrijven we een alternatieve methode van sarcomere-etikettering, met behulp van adeno-geassocieerde virussen (AAV’s), die op grote schaal kunnen worden toegepast op iPS-cellen die van de patiënt zijn afgeleid.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CMs hebben een groot potentieel om te worden gebruikt als een in vitro platform om hartaandoeningen te modelleren en de effecten van geneesmiddelen te testen. Niettemin moet eerst een nauwkeurige, uniforme methode worden vastgesteld om de functies van PSC-CMs te beoordelen. De meeste functionele tests werken met PSC-CMs, bijvoorbeeld elektrofysiologie, calcium transiënt en metabolisme26, en een van de eerste patiënt-afgeleide PSC-CM studies ging over long-QT syndroom<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag alle lableden van de afdeling Regeneratieve Geneeskunde van de Jichi Medical University erkennen voor de nuttige discussie en technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door de subsidies van het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 en JP20bm0804018), de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), en de Japanese Circulation Society (de Grant for Basic Research) aan H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
