Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.
Summary
Cette méthode peut être utilisée pour examiner le raccourcissement des sarcomères à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes avec des protéines sarcomères marquées par fluorescence.
Abstract
Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes (PSC-MC) peuvent être produits à partir de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites (ES/iPS). Ces cellules fournissent des sources prometteuses pour la modélisation des maladies cardiaques. Pour les cardiomyopathies, le raccourcissement des sarcomères est l’une des évaluations physiologiques standard qui sont utilisées avec les cardiomyocytes adultes pour examiner leurs phénotypes de la maladie. Cependant, les méthodes disponibles ne sont pas appropriées pour évaluer la contractilité de PSC-CMs, car ces cellules ont des sarcomères sous-développés qui sont invisibles sous la microscopie à contraste de phase. Pour résoudre ce problème et pour effectuer le raccourcissement des sarcomères avec psc-CMs, des protéines sarcomères marquées par fluorescence et une imagerie vivante fluorescente ont été utilisées. Les lignes Z minces et une ligne M résident aux deux extrémités et au centre d’un sarcomere, respectivement. Les protéines de la lignée Z — α-actinine (ACTN2), téléthonine (TCAP) et protéine LIM associée à l’actine (PDLIM3) — et une protéine de la lignée M — myomésine-2 (Myom2) — ont été marquées avec des protéines fluorescentes. Ces protéines marquées peuvent être exprimées à partir d’allèles endogènes sous forme de knock-ins ou de virus adéno-associés (AAV). Ici, nous présentons les méthodes permettant de différencier les cellules souches pluripotentes de souris et d’humains en cardiomyocytes, de produire des AAV et d’effectuer et d’analyser l’imagerie en direct. Nous décrivons également les méthodes pour produire des timbres de polydimethylsiloxane (PDMS) pour une culture modelée de PSC-CMs, qui facilite l’analyse du rapetissement de sarcomere avec des protéines fluorescent-marquées. Pour évaluer le raccourcissement sarcomere, des images de time-lapse des cellules battantes ont été enregistrées à un framerate élevé (50-100 images par seconde) sous la stimulation électrique (0.5-1 hertz). Pour analyser la longueur des sarcomères au cours de la contraction cellulaire, les images time-lapse enregistrées ont été soumises à SarcOptiM, un plug-in pour ImageJ/Fiji. Notre stratégie fournit une plate-forme simple pour étudier les phénotypes des maladies cardiaques dans psc-CMs.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde1 et la cardiomyopathie représente la troisième cause de décès liés au cœur2. La cardiomyopathie est un groupe collectif de maladies qui affectent les muscles cardiaques. Les développements récents des cellules souches pluripotentes induites (iPS) et la différenciation dirigée des cellules iPS vers les cardiomyocytes (PSC-CMs) ont ouvert la porte à l’étude des cardiomyocytes avec le génome du patient comme modèle in vitro de cardiomyopathie. Ces cellules peuvent être utilisées pour comprendre la physiopathologie des maladies cardiaques, pour élucider leurs mécanismes moléculaires, et pour tester différents candidats thérapeutiques3. Il y a une énorme quantité d’intérêt, ainsi, des cellules iPS dérivées du patient ont été générées (par exemple, cardiomyopathie hypertrophique [HCM]4,5,cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène [ARVC]6,cardiomyopathie dilaté [DCM]7,et cardiomyopathies liées aux mitochondries8,9). Puisque l’une des caractéristiques de la cardiomyopathie est le dysfonctionnement et la perturbation des sarcomères, un outil valide qui mesure uniformément la fonction sarcomere est nécessaire.
Le raccourcissement des sarcomères est la technique la plus largement utilisée pour évaluer la fonction des sarcomères et la contractilité des cardiomyocytes adultes dérivés de modèles animaux et d’humains. Pour effectuer le raccourcissement sarcomère, des sarcomères bien développés qui sont visibles sous contraste de phase sont nécessaires. Cependant, psc-CMs cultivé in vitro montrent des sarcomères sous-développés et désorganisés et, par conséquent, ne peuvent pas être utilisés pour mesurer correctement sarcomere raccourcissement10. Cette difficulté à évaluer correctement la contractilité des PSC-GC entrave leur utilisation comme plate-forme pour évaluer les fonctions cardiaques in vitro. Pour évaluer indirectement la contractilité psc-CMs, la microscopie à force atomique, les réseaux de micro-poteaux, la microscopie de force de traction et les mesures d’impédance ont été utilisés pour mesurer les effets du mouvement exercé par ces cellules sur leur environnement11,12,13. Des enregistrements de microscopie vidéo plus sophistiqués et moins invasifs du mouvement cellulaire réel (par exemple, SI8000 de SONY) peuvent être utilisés pour évaluer alternativement leur contractilité, cependant, cette méthode ne mesure pas directement le mouvement sarcomère ou la cinétique de génération de force14.
Pour mesurer directement le mouvement des sarcomères dans les GC-PSC, de nouvelles approches, telles que le marquage fluorescent de la protéine sarcomère, émergent. Par exemple, Lifeact est utilisé pour étiqueter l’actine filamenteuse (F-actine) pour mesurer le mouvement sarcomère15,16. Les cellules iPS génétiquement modifiées sont une autre option pour marquer les protéines sarcomères (par exemple, α-actinine [ACTN2] et myométsine-2 [MYOM2]) par la protéine fluorescente17,18,19.
Dans cet article, nous décrivons comment effectuer l’imagerie time-lapse pour mesurer le raccourcissement des sarcomères à l’aide de Myom2-TagRFP (cellules souches embryonnaires [ES] de souris) et d’ACTN2-mCherry (cellules iPS humaines). Nous montrons également qu’une culture à motifs facilite l’alignement des sarcomères. En outre, nous décrivons une méthode alternative de étiquetage sarcomere, utilisant les virus adeno-associés (AAVs), qui peuvent être largement appliqués aux cellules patient-dérivées d’iPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Psc-CMs ont un grand potentiel pour être utilisé comme une plate-forme in vitro pour modéliser les maladies cardiaques et pour tester les effets des médicaments. Néanmoins, il faut d’abord établir une méthode précise et unifiée d’évaluation des fonctions des GC-CFP. La plupart des tests fonctionnels fonctionnent avec PSC-CMs, par exemple, électrophysiologie, calcium transitoire, et métabolisme26, et l’une des premières études psc-cm patient-dérivées était au sujet d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire de la Division de médecine régénérative de l’Université médicale de Jichi pour la discussion utile et l’assistance technique. Cette étude a été soutenue par les subventions de l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED; JP18bm0704012 et JP20bm0804018), la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS; JP19KK0219), et la Japanese Circulation Society (la subvention pour la recherche fondamentale) à H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
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