Sarkomere-Verkürzung von pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung fluoreszierender Sarkomere-Proteine.
Summary
Diese Methode kann verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung mit pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit fluoreszierend markierten Sarkomerproteinen zu untersuchen.
Abstract
Pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (PSC-CMs) können sowohl aus embryonalen als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen (ES/iPS) hergestellt werden. Diese Zellen bieten vielversprechende Quellen für die Modellierung von Herzerkrankungen. Bei Kardiomyopathien ist die Sarkomer-Verkürzung eine der physiologischen Standardbewertungen, die bei erwachsenen Kardiomyozyten zur Untersuchung ihrer Krankheitsphänotypen verwendet werden. Die verfügbaren Methoden sind jedoch nicht geeignet, die Kontraktilität von PSC-CMs zu beurteilen, da diese Zellen unterentwickelte Sarkomere aufweisen, die unter Phasenkontrastmikroskopie unsichtbar sind. Um dieses Problem anzugehen und eine Sarkomerverkürzung mit PSC-CMs durchzuführen, wurden fluoreszierend markierte Sarkomerproteine und fluoreszierende Live-Bildgebung verwendet. Dünne Z-Linien und eine M-Linie befinden sich an beiden Enden bzw. in der Mitte eines Sarkomers. Z-Linienproteine – α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) und Aktin-assoziiertes LIM-Protein (PDLIM3) – und ein M-Linienprotein – Myomesin-2 (Myom2) – wurden mit fluoreszierenden Proteinen markiert. Diese markierten Proteine können aus endogenen Allelen als Knock-Ins oder aus Adeno-assoziierten Viren (AAVs) exprimiert werden. Hier stellen wir die Methoden vor, um maus- und humane pluripotente Stammzellen zu Kardiomyozyten zu differenzieren, AAVs herzustellen und Live-Imaging durchzuführen und zu analysieren. Wir beschreiben auch die Methoden zur Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempeln für eine gemusterte Kultur von PSC-CMs, die die Analyse der Sarkomerverkürzung mit fluoreszierend markierten Proteinen erleichtert. Zur Beurteilung der Sarkomerverkürzung wurden Zeitrafferbilder der schlagenden Zellen mit einer hohen Bildrate (50-100 Bilder pro Sekunde) unter elektrischer Stimulation (0,5-1 Hz) aufgenommen. Um die Sarkomerlänge im Verlauf der Zellkontraktion zu analysieren, wurden die aufgenommenen Zeitrafferbilder SarcOptiM, einem Plug-in für ImageJ/Fiji, unterzogen. Unsere Strategie bietet eine einfache Plattform für die Untersuchung von Phänotypen von Herzerkrankungen in PSC-CMs.
Introduction
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache1 und Kardiomyopathie stellt die dritte Ursache für kardiale Todesfälledar 2. Kardiomyopathie ist eine kollektive Gruppe von Krankheiten, die die Herzmuskulatur betreffen. Die jüngsten Entwicklungen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) und die gerichtete Differenzierung von iPS-Zellen in Richtung Kardiomyozyten (PSC-CMs) haben die Tür für die Untersuchung von Kardiomyozyten mit Patientengenom als In-vitro-Modell der Kardiomyopathie geöffnet. Diese Zellen können verwendet werden, um die Pathophysiologie von Herzerkrankungen zu verstehen, ihre molekularen Mechanismen aufzuklären und verschiedene therapeutische Kandidaten zu testen3. Es gibt ein enormes Interesse, so dass patientenabgeleitete iPS-Zellen erzeugt wurden (z. B. hypertrophe Kardiomyopathie [HCM]4,5, arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie [ARVC]6, dilatative Kardiomyopathie [DCM]7und mitochondriale Kardiomyopathien8,9). Da eines der Merkmale der Kardiomyopathie die Dysfunktion und Störung von Sarkomeren ist, wird ein gültiges Werkzeug benötigt, das die Sarkomerfunktion einheitlich misst.
Die Sarkomer-Verkürzung ist die am weitesten verbreitete Technik zur Beurteilung der Sarkomerfunktion und der Kontraktilität von erwachsenen Kardiomyozyten aus Tiermodellen und Menschen. Um eine Sarkomerverkürzung durchzuführen, sind gut entwickelte Sarkomere erforderlich, die unter Phasenkontrast sichtbar sind. PSC-CMs, die in vitro kultiviert wurden, zeigen jedoch unterentwickelte und unorganisierte Sarkomere und können daher nicht verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung richtig zu messen10. Diese Schwierigkeit, die Kontraktilität von PSC-CMs richtig einzuschätzen, behindert ihre Nutzung als Plattform zur Beurteilung der Herzfunktionen in vitro. Um die Kontraktilität von PSC-CMs indirekt zu beurteilen, wurden Rasterkraftmikroskopie, Mikropfostenarrays, Zugkraftmikroskopie und Impedanzmessungen verwendet, um die Auswirkungen der von diesen Zellen ausgeübten Bewegung auf ihre Umgebung zu messen11,12,13. Ausgefeiltere und weniger invasive Videomikroskopie-Aufnahmen tatsächlicher zellulärer Bewegungen (z. B. SI8000 von SONY) können alternativ zur Beurteilung ihrer Kontraktilität verwendet werden, diese Methode misst jedoch nicht direkt die Sarkomerbewegung oder die Krafterzeugungskinetik14.
Um die Sarkomerbewegung in PSC-CMs direkt zu messen, entstehen neue Ansätze, wie das Fluoreszenz-Tagging zu Sarkomerprotein. Zum Beispiel wird Lifeact verwendet, um filamentöses Aktin (F-Aktin) zu kennzeichnen, um die Sarkomerbewegung15,16zu messen. Gentechnisch veränderte iPS-Zellen sind eine weitere Möglichkeit, Sarkomerproteine (z.B. α-Actinin [ACTN2] und Myomesin-2 [MYOM2]) durch fluoreszierendes Protein17,18,19zu markieren.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie zeitrafferbildende Bildgebung zur Messung der Sarkomerverkürzung mit Myom2-TagRFP (mausembryonale Stammzellen [ES]) und ACTN2-mCherry (menschliche iPS-Zellen) durchgeführt werden kann. Wir zeigen auch, dass eine gemusterte Kultur die Ausrichtung von Sarkomern erleichtert. Darüber hinaus beschreiben wir eine alternative Methode der Sarkomer-Markierung unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAVs), die weit verbreitet auf patientenbasierte iPS-Zellen angewendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CMs haben ein großes Potenzial, als In-vitro-Plattform zur Modellierung von Herzerkrankungen und zur Prüfung der Wirkung von Medikamenten genutzt zu werden. Dennoch muss zunächst eine genaue, einheitliche Methode zur Bewertung der Funktionen von PSC-CMs etabliert werden. Die meisten Funktionstests arbeiten mit PSC-CMs, z. B. Elektrophysiologie, Calciumtransient und Stoffwechsel26,und eine der ersten patientenbasierten PSC-CM-Studien war über das Long-QT-Syndrom27…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten allen Labormitgliedern in der Abteilung für Regenerative Medizin an der Jichi Medical University für die hilfreiche Diskussion und technische Unterstützung danken. Diese Studie wurde durch die Zuschüsse der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 und JP20bm0804018), die Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219) und der Japanese Circulation Society (der Zuschuss für Grundlagenforschung) an H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
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