Histotripsy-aided lytic delivery of lysotripsy is in ontwikkeling voor de behandeling van diepe veneuze trombose. Een in vitro procedure wordt hier gepresenteerd om de werkzaamheid van deze combinatietherapie te beoordelen. Belangrijke protocollen voor het stolselmodel, beeldbegeleiding en beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling worden besproken.
Diepe veneuze trombose (DVT) is een wereldwijd gezondheidsprobleem. De primaire benadering om vaatrekanalisatie voor kritieke obstructies te bereiken, is kathetergerichte trombolytica (CDT). Om bijtende bijwerkingen en de lange behandelingstijd geassocieerd met CDT te verminderen, zijn adjuvante en alternatieve benaderingen in ontwikkeling. Een van die benaderingen is histotripsy, een gerichte ultrasone therapie om weefsel te aborteren via bubbelwolknucleatie. Preklinische studies hebben een sterke synergie aangetoond tussen histotripsie en trombolytica voor stolselafbraak. Dit rapport schetst een benchtop-methode om de werkzaamheid van histotripsy-aided trombolytische therapie of lysotripsie te beoordelen.
Stolsels vervaardigd uit vers menselijk veneus bloed werden geïntroduceerd in een stroomkanaal waarvan de afmetingen en acousto-mechanische eigenschappen een iliofemorale ader nabootsen. Het kanaal was doordrenkt met plasma en de lytische recombinante weefseltype plasminogeen activator. Bubbelwolken werden gegenereerd in het stolsel met een gerichte ultrasone bron ontworpen voor de behandeling van femorale veneuze stolsels. Gemotoriseerde positioners werden gebruikt om de bronfocus langs de stolsellengte te vertalen. Op elke insonatielocatie werden akoestische emissies van de bellenwolk passief geregistreerd en straalgevormd om passieve cavitatiebeelden te genereren. Metrieken om de werkzaamheid van de behandeling te meten, omvatten stolselmassaverlies (algehele werkzaamheid van de behandeling) en de concentraties van D-dimeer (fibrinolyse) en hemoglobine (hemolyse) in het perfusaat. Er zijn beperkingen aan dit in vitro ontwerp, waaronder een gebrek aan middelen om in vivo bijwerkingen of dynamische veranderingen in de stroomsnelheid te beoordelen naarmate het stolsel lyseert. Over het algemeen biedt de opstelling een effectieve methode om de werkzaamheid van op histotripsy gebaseerde strategieën voor de behandeling van DVT te beoordelen.
Trombose is de toestand van stolselvorming in een verder gezond bloedvat dat de bloedsomloop belemmert1,2. Veneuze trombo-embolie heeft een jaarlijkse gezondheidszorgkost van $ 7-10 miljard, met 375.000-425.000 gevallen in de Verenigde Staten3. Longembolie is de obstructie van de longslagader en is het ernstigste gevolg van veneuze trombo-embolie. De primaire bron van longobstructie is diepe veneuze trombi, voornamelijk van iliofemorale veneuze segmenten4,5,6. Diepe veneuze trombose (DVT) heeft inherente gevolgen naast pulmonale obstructies, met complicaties op lange termijn die resulteren in pijn, zwelling, beenzweren en ledemaat amputaties7,8,9. Voor kritieke obstructies zijn kathetergerichte trombolytica (CDT) de eerstelijnsbenadering voor vatrekanalisatie10. De uitkomst van CDT hangt af van een aantal factoren, waaronder trombusleeftijd, locatie, grootte, samenstelling, etiologie en patiëntrisicocategorie11. Bovendien wordt CDT geassocieerd met vasculaire schade, infecties, bloedingscomplicaties en lange behandelingstijd10. Apparaten van de volgende generatie zijn gericht op het combineren van mechanische trombectomie met trombolytica (d.w.z. farmacomechanische trombectomie)12,13. Het gebruik van deze apparaten verlaagt de lytische dosering, wat leidt tot verminderde bloedingscomplicaties en verkorte de behandelingstijd12,13,14 in vergelijking met CDT. Deze apparaten hebben nog steeds problemen met hemorragische bijwerkingen en onvolledige verwijdering van chronische trombi15. Er is dus een adjuvante strategie nodig die de trombus volledig kan verwijderen met lagere bloedingscomplicaties.
Een mogelijke benadering is histotripsy-aided trombolytische behandeling, aangeduid als lysotripsy. Histotripsy is een niet-invasieve behandelingsmodaliteit die gerichte echografie gebruikt om bubbelwolken in weefsels te nucleeren16. Bubbelactiviteit wordt niet gegenereerd via exogene kernen, maar door de toepassing van ultrasone pulsen met voldoende spanning om kernen te activeren die intrinsiek zijn aan weefsels, waaronder stolsel17,18. De mechanische oscillatie van de bellenwolk geeft spanning aan het stolsel, waardoor de structuur uiteenvalt in acellulair puin19. Histotripsy bubbelactiviteit zorgt voor een effectieve afbraak van ingetrokken en niet-teruggetrokken bloedstolsels, zowel in vivo als in vitro20,21,22. Eerdere studies hebben23,24 aangetoond dat de combinatie van histotripsie en de lytische recombinante weefseltype plasminogeenactivator (rt-PA) de werkzaamheid van de behandeling aanzienlijk verhoogt in vergelijking met lytisch alleen of histotripsie alleen. Er wordt verondersteld dat twee primaire mechanismen geassocieerd met histotripsy bubbelactiviteit verantwoordelijk zijn voor de verbeterde werkzaamheid van de behandeling: 1) verhoogde fibrinolyse als gevolg van verbeterde lytische afgifte en 2) hemolyse van rode bloedcellen in het stolsel. Het grootste deel van de stolselmassa bestaat uit rode bloedcellen24en daarom is het volgen van de afbraak van erytrocyten een goed surrogaat voor ablatie van het monster. Andere gevormde stolselelementen zijn waarschijnlijk ook gedesintegreerd onder histotripsy bubbelactiviteit, maar worden niet in dit protocol overwogen.
Hier wordt een benchtop-benadering geschetst om DVT in vitro met lysotripsie te behandelen. Het protocol beschrijft kritische operationele parameters van de histotripsiebron, beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling en beeldbegeleiding. Het protocol omvat het ontwerpen van een stroomkanaal om een iliofemoraal veneus segment na te bootsen en het produceren van menselijke volbloedstolsels. De experimentele procedure schetst de positionering van de histotripsiebron en beeldvormingsarray om histotripsy-blootstelling te bereiken langs het stolsel dat in het stroomkanaal is geplaatst. Relevante insonatieparameters om stolselverstoring te bereiken en off-target bubbelactiviteit te minimaliseren, worden gedefinieerd. Het gebruik van echografie voor begeleiding en beoordeling van bubbelactiviteit wordt geïllustreerd24. Statistieken om de werkzaamheid van de behandeling te kwantificeren, zoals stolselmassaverlies, D-dimeer (fibrinolyse) en hemoglobine (hemolyse) worden geschetst23,24,25,26,27. Over het algemeen biedt de studie een effectief middel voor het uitvoeren en beoordelen van de werkzaamheid van lysotripsy om DVT te behandelen.
Het voorgestelde protocol presenteert een model om de werkzaamheid van lysotripsy bij de behandeling te kwantificeren. Hoewel de belangrijkste details zijn besproken, zijn er bepaalde kritieke aspecten waarmee rekening moet worden gehouden voor het succes van dit protocol. De enzymatische activiteit van rt-PA heeft een Arrhenius temperatuurafhankelijkheid30. Temperatuur is ook een factor die bijdraagt aan de snelheid van geluid in water en weefsel, en variaties in temperatuur kunnen kleine verande…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health, Grant R01HL13334. De auteurs willen Dr. Kevin Haworth bedanken voor het assisteren bij drabkin’s test en Dr. Viktor Bollen voor zijn steun bij het ontwerpen van het protocol. De auteurs zijn ook Dr. Adam Maxwell dankbaar voor zijn begeleiding bij het ontwerpen van de histotripsy bron.
Absorbing sheets | Precision acoustics | F28-SMALL-M | 300mm x 300 mm x 10 mm |
Borosilicate Pasteur pippettes | Fisher Scientific | 1367820A | 14.6 cm length, 2 mL capacity |
Centrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL capacity |
Drabkin's assay | Sigma Aldrich | D5941-6VL | |
Draw syringe | Cole-Parmer | EW-07945-43 | 60 mL capacity |
Filter bags | McMaster-Carr | 5162K111 | Remove particle size upto 1 microns |
Flow channel tubing | McMaster-Carr | 5154K25 | Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4" |
Heating elements | Won Brothers | HT 300 Titanium | Titanium rods placed at the bottom of tank |
Imaging array | Verasonics | L11-5v | 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB |
Low gelling agarose | Millipore Sigma | A9414 | |
Model vessel | McMaster-Carr | 5234K98 | 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness |
Nanopure water | Barnstead | Nanopure Diamond | ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity |
Plasma | Vitalant | 4PF000 | Plasma frozen within 24 hours |
Plate reader | Biotek | Synergy Neo HST Plate Reader | For haemoglobin quantification |
Probe cover | Civco | 610-362 | |
Programming platform | MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA) | ||
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) | Genentech | Activase | |
Reservoir | Cole-Parmer | EW-07945-43 | 60 mL capacity |
Syringe pump | Cole-Parmer | EW-74900-20 | pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate |
Transducer | In-house customized | Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network | |
Ultrasound scaning system | Verasonics | Vantage Research Ultrasound System | |
Water tank | Advanced acrylics | C133 | 14 x 14 x 12, 1/2" |