Ein In-vitro-System zur Messung der thrombolytischen Wirksamkeit von Histotripsie und einem lytischen Medikament

Summary

Zur Behandlung einer tiefen Venenthrombose befindet sich eine histotripsiegestützte lytische Abgabe oder Lysotripsie in der Entwicklung. Hier wird ein In-vitro-Verfahren vorgestellt, um die Wirksamkeit dieser Kombinationstherapie zu beurteilen. Schlüsselprotokolle für das Gerinnselmodell, die Bildführung und die Bewertung der Behandlungswirksamkeit werden diskutiert.

Abstract

Tiefe Venenthrombose (DVT) ist ein globales Gesundheitsproblem. Der primäre Ansatz zur Gefäßrekanalisation bei kritischen Obstruktionen sind kathetergerichtete Thrombolytika (CDT). Um ätzende Nebenwirkungen und die lange Behandlungszeit im Zusammenhang mit CDT zu mildern, werden adjuvante und alternative Ansätze entwickelt. Ein solcher Ansatz ist die Histotripsie, eine fokussierte Ultraschalltherapie zur Ablate von Gewebe durch Blasenwolkenkeimbildung. Präklinische Studien haben eine starke Synergie zwischen Histotripsie und Thrombolytika für den Gerinnselabbau gezeigt. Dieser Bericht beschreibt eine Benchtop-Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit der histotripsiegestützten thrombolytischen Therapie oder Lysotripsie.

Gerinnsel, die aus frischem menschlichem Venenblut hergestellt wurden, wurden in einen Strömungskanal eingeführt, dessen Abmessungen und akustomechanische Eigenschaften eine iliofemorale Vene nachahmen. Der Kanal wurde mit Plasma und dem lytischen rekombinanten Gewebetyp Plasminogenaktivator durchblutet. Blasenwolken wurden im Gerinnsel mit einer fokussierten Ultraschallquelle erzeugt, die für die Behandlung von femoralvenösen Gerinnseln entwickelt wurde. Motorisierte Positionierer wurden verwendet, um den Quellfokus entlang der Gerinnsellänge zu übersetzen. An jedem Insonationsort wurden akustische Emissionen aus der Blasenwolke passiv aufgezeichnet und beamgeformt, um passive Kavitationsbilder zu erzeugen. Metriken zur Messung der Behandlungswirksamkeit umfassten den Verlust der Gerinnselmasse (Gesamtwirksamkeit der Behandlung) und die Konzentrationen von D-Dimer (Fibrinolyse) und Hämoglobin (Hämolyse) im Perfusat. Es gibt Einschränkungen für dieses In-vitro-Design, einschließlich des Fehlens von Mitteln zur Beurteilung von In-vivo-Nebenwirkungen oder dynamischen Änderungen der Durchflussrate, wenn das Gerinnsel lysiert. Insgesamt bietet das Setup eine effektive Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit von Histotripsie-basierten Strategien zur Behandlung von TVT.

Introduction

Thrombose ist der Zustand der Gerinnselbildung in einem ansonsten gesunden Blutgefäß, das die Durchblutung behindert^1,2. Venöse Thromboembolien haben jährliche Gesundheitskosten von 7-10 Milliarden US-Dollar, mit 375.000-425.000 Fällen in den Vereinigten Staaten³. Lungenembolie ist die Obstruktion der Lungenarterie und ist die schwerwiegendste Folge der venösen Thromboembolie. Die primäre Quelle der Lungenobstruktion sind tiefe Venenthrombolien, hauptsächlich aus iliofemoralen venenösen Segmenten^4,5,6. Tiefe Venenthrombose (DVT) hat inhärente Folgeerscheinungen neben Lungenobstruktionen, mit langfristigen Komplikationen, die zu Schmerzen, Schwellungen, Beingeschwüren und Gliedmaßenamputationen führen^7,8,9. Bei kritischen Obstruktionen sind kathetergerichtete Thrombolytika (CDT) der Frontline-Ansatz für die Gefäßrekanalisation¹⁰. Das Ergebnis der CDT hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter Thrombusalter, Ort, Größe, Zusammensetzung, Ätiologie und Patientenrisikokategorie¹¹. Darüber hinaus ist CDT mit Gefäßschäden, Infektionen, Blutungskomplikationen und langer Behandlungszeit verbunden¹⁰. Geräte der nächsten Generation zielen darauf ab, mechanische Thrombektomie mit Thrombolytika (d.h. pharmakomechanischer Thrombektomie) zu kombinieren^12,13. Die Verwendung dieser Geräte senkt die lytische Dosierung, was zu reduzierten Blutungskomplikationen führt, und verkürzt die Behandlungszeit^12,13,14 im Vergleich zu CDT. Diese Geräte behalten immer noch Probleme mit hämorrhagischen Nebenwirkungen und unvollständiger Entfernung chronischer Thromben¹⁵. Es bedarf daher einer adjuvanten Strategie, die den Thrombus mit geringeren Blutungskomplikationen vollständig entfernen kann.

Ein möglicher Ansatz ist die histotripsiegestützte thrombolytische Behandlung, die als Lysotripsie bezeichnet wird. Histotripsie ist eine nicht-invasive Behandlungsmodalität, die fokussierten Ultraschall verwendet, um Blasenwolken in Geweben zu nukleieren¹⁶. Die Blasenaktivität wird nicht über exogene Kerne erzeugt, sondern durch die Anwendung von Ultraschallimpulsen mit ausreichender Spannung, um Gewebekerne zu aktivieren, einschließlich Gerinnsel^17,18. Die mechanische Schwingung der Blasenwolke belastet das Gerinnsel und zerfällt die Struktur in azelluläre Trümmer¹⁹. Die Histotripsie-Blasenaktivität sorgt für einen effektiven Abbau von eingezogenen und nicht retraktierten Blutgerinnseln sowohl in vivo als auch in vitro^20,21,22. Frühere Studien haben^23,24 gezeigt, dass die Kombination von Histotripsie und dem lytischen rekombinanten Gewebetyp-Plasminogenaktivator (rt-PA) die Behandlungswirksamkeit im Vergleich zu lytischen allein oder Histotripsie allein signifikant erhöht. Es wird angenommen, dass zwei primäre Mechanismen, die mit der Histotripsie-Blasenaktivität verbunden sind, für die verbesserte Wirksamkeit der Behandlung verantwortlich sind: 1) erhöhte Fibrinolyse aufgrund einer verbesserten lytischen Abgabe und 2) Hämolyse der roten Blutkörperchen im Gerinnsel. Der Großteil der Gerinnselmasse besteht aus roten Blutkörperchen²⁴, und daher ist die Verfolgung des Erythrozytenabbaus ein guter Ersatz für die Ablation der Probe. Andere gebildete Gerinnselelemente werden wahrscheinlich auch unter Histotripsie-Blasenaktivität zerfallen, werden aber in diesem Protokoll nicht berücksichtigt.

Hier wird ein Benchtop-Ansatz zur Behandlung von TVT in vitro mit Lysotripsie skizziert. Das Protokoll beschreibt kritische Betriebsparameter der Histotripsiequelle, die Beurteilung der Behandlungswirksamkeit und die Bildführung. Das Protokoll umfasst die Entwicklung eines Strömungskanals zur Nachahmung eines iliofemoralen Venensegments und die Herstellung menschlicher Vollblutgerinnsel. Das experimentelle Verfahren beschreibt die Positionierung der Histotripsiequelle und des Bildgebungsarrays, um eine Histotripsie-Exposition entlang des im Strömungskanal platzierten Gerinnsels zu erreichen. Relevante Insonationsparameter, um gerinnselunterbrechungen zu erreichen und die Blasenaktivität außerhalb des Ziels zu minimieren, werden definiert. Die Verwendung von Ultraschallbildgebung zur Führung und Beurteilung der Blasenaktivität wird veranschaulicht²⁴. Metriken zur Quantifizierung der Behandlungswirksamkeit wie Gerinnselmassenverlust, D-Dimer (Fibrinolyse) und Hämoglobin (Hämolyse) werden^{23,24,25,26,27}beschrieben. Insgesamt bietet die Studie ein wirksames Mittel zur Durchführung und Bewertung der Wirksamkeit von Lysotripsie zur Behandlung von TVT.

Protocol

Für die hier vorgestellten Ergebnisse wurde venöses menschliches Blut entnommen, um Gerinnsel zu bilden, nachdem das lokale interne Überprüfungsgremium (IRB # 19-1300) genehmigt und die schriftliche Einwilligung freiwilliger Spender24erteilt wurde. In diesem Abschnitt wird ein Entwurfsprotokoll zur Beurteilung der Wirksamkeit der Lysotripsie beschrieben. Das Protokoll basiert auf einer früheren Arbeit von Bollen et al.24. 1. Gerinnselmodellier…

Representative Results

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll hebt die Details der venösen Gerinnselmodellierung, der Lysotripsie bei Gerinnselstörungen und der Ultraschallbildgebung in einem In-vitro-Setup der TVT hervor. Das gewählte Verfahren zeigt die Schritte, die zur Beurteilung der Gerinnselstörung aufgrund der kombinierten Effekte von rt-PA und histotripsy Bubble Cloud-Aktivität erforderlich sind. Das Benchtop-Setup wurde entwickelt, um die Eigenschaften einer venösen Iliofemoralvene nachzuahmen. Abbildu…

Discussion

Das vorgeschlagene Protokoll stellt ein Modell zur Quantifizierung der Behandlungswirksamkeit von Lysotripsie dar. Während die wichtigsten Details diskutiert wurden, gibt es bestimmte kritische Aspekte, die für den Erfolg dieses Protokolls zu berücksichtigen sind. Die enzymatische Aktivität von rt-PA hat eine Arrhenius-Temperaturabhängigkeit³⁰. Die Temperatur ist auch ein Faktor für die Schallgeschwindigkeit in Wasser und Gewebe, und Temperaturschwankungen können geringfügige Veränderunge…

Materials

Absorbing sheets	Precision acoustics	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes	Fisher Scientific	1367820A	14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL capacity
Drabkin's assay	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Draw syringe	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Filter bags	McMaster-Carr	5162K111	Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing	McMaster-Carr	5154K25	Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements	Won Brothers	HT 300 Titanium	Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array	Verasonics	L11-5v	128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose	Millipore Sigma	A9414
Model vessel	McMaster-Carr	5234K98	6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma frozen within 24 hours
Plate reader	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	For haemoglobin quantification
Probe cover	Civco	610-362
Programming platform	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservoir	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Syringe pump	Cole-Parmer	EW-74900-20	pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer	In-house customized		Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system	Verasonics		Vantage Research Ultrasound System
Water tank	Advanced acrylics	C133	14 x 14 x 12, 1/2"