Summary

מערכת במבחנה לאמוד את היעילות התרומבוליטית של היסטוטרפסיה וסם ליטיק

Published: June 04, 2021
doi:

Summary

לידה ליטית בסיוע היסטוטרפסיה או ליזוזטריפסיה נמצאת בפיתוח לטיפול פקקת ורידים עמוקים. הליך במבחנה מוצג כאן כדי להעריך את היעילות של טיפול משולב זה. פרוטוקולים מרכזיים עבור מודל קריש דם, הדרכת תמונה, והערכה של יעילות הטיפול נדונים.

Abstract

פקקת ורידים עמוקים (DVT) היא דאגה בריאותית עולמית. הגישה העיקרית להשגת recanalization כלי עבור חסימות קריטיות היא תרומבוליטיקה מכוונת צנתר (CDT). כדי למתן את תופעות הלוואי הקאוסטית ואת זמן הטיפול הארוך הקשורים CDT, אדג’ובנט וגישות חלופיות נמצאים בפיתוח. גישה אחת כזו היא היסטומטרפסיה, טיפול אולטרסאונד ממוקד כדי לנפח רקמה באמצעות התגרענות ענן בועה. מחקרים פרה-קליניים הראו סינרגיה חזקה בין היסטוטרפסיה וטרומבוליטיקה להשפלת קריש. דו”ח זה מתאר שיטת ספסל כדי להעריך את היעילות של טיפול תרומבוליטי בסיוע היסטוטרפסיה, או ליזוזטריפסיה.

קרישי דם המיוצרים מדם ורידים אנושי טרי הוכנסו לערוץ זרימה שמידותיו ומאפייניו האקוסטו-מכניים מחקים וריד איליו-פיומורלי. הערוץ היה מנוטרל בפלזמה ובמפעיל פלסמינוגן מסוג רקמה ליטית. ענני בועה נוצרו קריש עם מקור אולטרסאונד ממוקד המיועד לטיפול של קרישי וריד הירך. מיצובים ממונעים שימשו לתרגום מוקד המקור לאורך אורך הקריש. בכל מיקום הסתה, פליטות אקוסטיות מענן הבועה תועדו באופן פסיבי, וצורת קרן כדי ליצור תמונות cavitation פסיביות. מדדים לאמוד יעילות הטיפול כללו אובדן מסת קריש (יעילות הטיפול הכוללת), ואת הריכוזים של D-dimer (פיברינוליזה) והמוגלובין (המוליזה) ב perfusate. ישנן מגבלות על עיצוב במבחנה זו, כולל חוסר אמצעים להעריך תופעות לוואי vivo או שינויים דינמיים בקצב הזרימה כמו ליס קריש. בסך הכל, ההתקנה מספקת שיטה יעילה להערכת היעילות של אסטרטגיות מבוססות היסטוטריפסיה לטיפול ב- DVT.

Introduction

פקקת היא מצב של היווצרות קריש בכלי דם בריא אחרת שחוסם את זרימת הדם1,2. תרומבואמבוליזם ורידים יש עלות בריאות שנתית של $7-10 מיליארד, עם 375,000-425,000 מקרים בארצות הברית3. תסחיף ריאתי הוא חסימה של עורק הריאות והוא התוצאה החמורה ביותר של תרומבואמבוליזם ורידים. המקור העיקרי לחסימת ריאות הוא תרומבי וריד עמוק, בעיקר מקטעים ורידיים iliofemoral4,5,6. פקקת ורידים עמוקים (DVT) יש sequela אינהרנטי מלבד חסימות ריאות, עם סיבוכים לטווח ארוך שגורמים לכאב, נפיחות, כיבים ברגל, קטיעות גפיים7,8,9. עבור מכשולים קריטיים, תרומבוליטיקה מכוונת קטטר (CDT) הם הגישה החזיתית עבור recanalization כלי10. התוצאה של CDT תלויה במספר גורמים, כולל גיל תרומבוס, מיקום, גודל, הרכב, אטיולוגיה, וקטגוריה סיכון המטופל11. יתר על כן, CDT קשורה נזק לכלי הדם, זיהומים, סיבוכים דימום, וזמן טיפול ארוך10. התקנים הדור הבא שואפים לשלב פקקת מכנית עם תרומבוליטיקה (כלומר, פקקת פרמקומכנית)12,13. השימוש במכשירים אלה להוריד את המינון lytic המוביל סיבוכים דימום מופחת, וקיצר את זמן הטיפול12,13,14 בהשוואה CDT. התקנים אלה עדיין לשמור על בעיות של תופעות לוואי דימומיות והסרה חלקית של תרומבי כרוני15. אסטרטגיה אדג’ובנטית ולכן יש צורך שיכול להסיר את פקקת לחלוטין עם סיבוכים דימום נמוך יותר.

גישה פוטנציאלית אחת היא טיפול תרומבוליטי בסיוע היסטוטרפסיה, המכונה ליזוטריפסיה. היסטוטריפסיה היא שיטות טיפול לא פולשניות המשתמשת באולטרסאונד ממוקד כדי לגרעין ענני בועה ברקמות16. פעילות הבועה נוצרת לא באמצעות גרעינים אקסוגניים, אלא על ידי יישום של פולסים אולטרסאונד עם מתח מספיק כדי להפעיל גרעינים מהותיים לרקמות, כולל קריש17,18. התנודה המכנית של ענן הבועה מקנה מאמץ לקריש הדם, מתפוררת את המבנה לפסולת אסלורית19. פעילות בועת היסטוטרפסיה מספקת השפלה יעילה של קרישי דם נסוגים ובלתי מתמשכים הן ב- vivo והן במבחנה20,21,22. מחקרים קודמים הראוכי השילוב של היסטוטריפסיה ופעיל פלסמינוגן מסוג רקמה ליטית (rt-PA) מגביר באופן משמעותי את יעילות הטיפול בהשוואה ליטיק לבד או היסטוטריפסיה בלבד. ההשערה היא כי שני מנגנונים עיקריים הקשורים לפעילות בועת היסטוטרפסיה אחראים על יעילות הטיפול המשופרת: 1) פיברינוליזה מוגברת עקב מסירת ליטיק משופרת, ו -2) המוליזה של תאי דם אדומים בתוך הקריש. עיקר מסת קריש מורכב מתאי דם אדומים24, ולכן, מעקב אחר השפלת אריתרוציטים היא תחליף טוב עבור אבלציה של המדגם. אלמנטים אחרים נוצר קריש הם גם צפויים להתפורר תחת פעילות בועת היסטוטרפסיה אבל אינם נחשבים בפרוטוקול זה.

כאן, גישה benchtop לטיפול DVT במבחנה עם ליזוזטריפסיה הוא מתואר. הפרוטוקול מתאר פרמטרי הפעלה קריטיים של מקור היסטוטריפסיה, הערכת יעילות הטיפול והדרכה בתמונה. הפרוטוקול כולל תכנון ערוץ זרימה כדי לחקות קטע ורידים iliofemoral וייצור קרישי דם שלמים אנושיים. ההליך הניסיוני מתאר את המיקום של מקור היסטוטרפסיה ומערך הדמיה כדי להשיג חשיפה היסטוטרפסיה לאורך הקריש להציב בערוץ הזרימה. מוגדרים פרמטרי אינסונציה רלוונטיים להשגת הפרעות קריש ולמזער פעילות בועת מחוץ למטרה. השימוש בהדמיית אולטרסאונד להדרכה והערכה של פעילות הבועה מאויר24. מדדים לכימות יעילות הטיפול כגון אובדן מסת קריש דם, D-dimer (פיברינוליזה) ומוגלובין (המוליזה) מפורטים23,24,25,26,27. בסך הכל, המחקר מספק אמצעי יעיל לביצוע והערכה של היעילות של ליזוזטריפסיה לטיפול ב- DVT.

Protocol

לתוצאות המוצגות כאן, דם אנושי ורידי נמשך כדי ליצור קרישי דם לאחר אישור ועדת הבדיקה הפנימית המקומית (IRB #19-1300) והסכמה מדעת בכתב הניתנת על ידי תורמים מתנדבים24. סעיף זה מתאר פרוטוקול עיצוב להערכת יעילות ליזוזטריפסיה. הפרוטוקול מבוסס על עבודה קודמת של בולן ואח’24. <p clas…

Representative Results

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מדגיש את הפרטים של מידול קריש ורידים, ליזוזטריפסיה להפרעות קריש, והדמיה אולטרסאונד במבחנה של DVT. ההליך המאומץ מדגים את הצעדים הדרושים להערכת הפרעות קריש עקב ההשפעות המשולבות של פעילות ענן הבועה של rt-PA והיסטוטרפסיה. ההתקנה הספסל נועד לחקות את המאפיינים של וריד iliofe…

Discussion

הפרוטוקול המוצע מציג מודל לכימות יעילות הטיפול של ליזוטריפסיה. בעוד הפרטים העיקריים נדונו, ישנם היבטים קריטיים מסוימים שיש לקחת בחשבון להצלחת פרוטוקול זה. הפעילות האנזימטית של rt-PA יש תלות בטמפרטורת ארניוס30. הטמפרטורה היא גם גורם תורם למהירות הקול במים וברקמות, ושינויים בטמפ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, גרנט R01HL13334. המחברים רוצים להודות לד”ר קווין הוורת’ על שסייע לבדיקה של דרבקין ולד”ר ויקטור בולן על תמיכתו בעיצוב הפרוטוקול. המחברים מודים גם לד”ר אדם מקסוול על הדרכתו בעיצוב מקור היסטוטריפסיה.

Materials

Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. . Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -. T., Huang, C. -. Y., Hsu, C. -. P., Lee, C. -. Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -. C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A., Duck, F. A. . Physical Properties of Tissues. , 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).
check_url/62133?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

View Video