Isolation, kultur og genteknologi af pattedyr primære pigment epitelceller til ikke-viral genterapi

Summary

Her præsenteres en protokol om at isolere og transfekte primær iris og retinale pigment epitelceller fra forskellige pattedyr (mus, rotte, kanin, gris og kvæg). Metoden er velegnet til at studere okulære genterapimetoder i forskellige set-ups til ex vivo-analyser og in vivo-studier, der kan overføres til mennesker.

Abstract

Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er den hyppigste årsag til blindhed hos patienter >60 år, der påvirker ~ 30 millioner mennesker på verdensplan. AMD er en multifaktoriel sygdom påvirket af miljømæssige og genetiske faktorer, som fører til funktionel svækkelse af nethinden på grund af retinale pigment epitel (RPE) celledegeneration efterfulgt af fotoreceptor nedbrydning. En ideel behandling ville omfatte transplantation af sunde RPE-celler udskille neuroprotektive faktorer for at forhindre RPE celle død og fotoreceptor degeneration. På grund af de funktionelle og genetiske ligheder og muligheden for en mindre invasiv biopsi blev transplantation af irispigmentepileleceller (IPE) foreslået som erstatning for degenererede RPE. Udskillelse af neuroprotektive faktorer ved et lavt antal subretinally transplanterede celler kan opnås ved Tornerose (SB100X) transposon-medieret transfektion med gener, der koder for pigment epitel-afledt faktor (PEDF) og / eller granulocyt makrofag-koloni stimulerende faktor (GM-CSF). Vi etablerede isolation, kultur og SB100X-medieret transfection af RPE- og IPE-celler fra forskellige arter, herunder gnavere, grise og kvæg. Glober er explanted og hornhinden og linsen fjernes for at få adgang til iris og nethinden. Ved hjælp af en skræddersyet spatel fjernes IPE-celler fra den isolerede iris. For at høste RPE-celler kan en trypsinininkubation være påkrævet, afhængigt af arten. Derefter suspenderes cellerne med RPE-tilpasset spatel med medium. Efter såning overvåges cellerne to gange om ugen og overføres efter sammenløb ved elektroporation. Genintegration, udtryk, proteinsekretion og funktion blev bekræftet af qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence og funktionelle analyser. Afhængigt af arten kan 30.000-5 millioner (RPE) og 10.000-1,5 millioner (IPE) celler isoleres pr. Øje. Genetisk modificerede celler udviser betydelig PEDF/GM-CSF-overekspression med kapacitet til at reducere oxidativ stress og tilbyder et fleksibelt system til ex vivo-analyser og in vivo-undersøgelser, der kan overføres til mennesker for at udvikle okulære genterapitilgange.

Introduction

Vores gruppe fokuserer på udvikling af regenerative tilgange til behandling af neuroretinal degeneration, dvs. AMD, ved RPE- og IPE-baseret ikke-viral genterapi. Den prækliniske etablering af sådanne behandlinger kræver in vitro-modeller, der kan overføres til mennesker. Således er målet med undersøgelsen præsenteret her at levere protokoller for isolering, kultur og genteknologi af primære RPE- og IPE-celler. Begrundelsen for at etablere isolering af PE-celler fra flere arter er at bekræfte tilgangens sikkerhed og effektivitet og øge dens reproducerbarhed og overførbarhed. Den tilgængelige menneskelige RPE-cellelinje ARPE-19 adskiller sig fra primære celler (f.eks. er de mindre pigmenterede) og er derfor kun af begrænset værdi for prækliniske analyser¹. Derudover kan ikke-menneskelige pattedyrceller købes til mindre omkostninger og i større mængder; human donorvæv kan fås fra forskellige Eye Banks, men tilgængeligheden er begrænset og dyr. Endelig skal nye lægemidler til avanceret terapi (ATMP, dvs. celle-, vævs- eller genterapilægemiddel) anvendes i mindst to forskellige arter, før de testes hos patienter, og disse in vivo-undersøgelser anmoder om forberedelse af allogene celletransplantationer.

Retinal neurodegenerative sygdomme er den hyppigste årsag til blindhed i de industrialiserede lande, der omfatter almindelige sygdomme som AMD, samt sjældne sygdomme som retinitis pigmentosa, hvor nethinden celledød i sidste ende fører til blindhed. RPE celler, fotoreceptor, og retinal ganglion celler (RGC) skader kan i nogle tilfælde bremses, men der er i øjeblikket ingen helbredende behandlinger til rådighed. ATMPs giver mulighed for at korrigere gendefekter, integrere terapeutiske gener eller erstatte degenererede celler, hvilket muliggør udvikling af regenerative og helbredende behandlinger for sygdomme som AMD; 13 genterapier allerede fået markedsføring godkendelse, herunder en behandling til behandling af RPE65 mutation-associerede retinal degeneration^2,3. Blandt ældre voksne (>60 år), ~ 30 millioner mennesker verden over er påvirket af enten neovaskulære (nvAMD) eller avaskulære (aAMD) AMD⁴. Begge former er induceret af aldersrelaterede udløsere, herunder oxidative skader, funktionsnedsættelse og tab af RPE-celler efterfulgt af fotoreceptorforringelse, blandt andre (f.eks. genetisk risiko alleler, rygning, forhøjet blodtryk)^5,6. I nvAMD forværres patogenese af en ubalance af angiogene og anti-angiogene faktorer til fordel for den angiogene Vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF), der fremkalder choroidal neovascularization (CNV). Til dato kan kun nvAMD behandles ved månedlige intravitreale injektioner af hæmmere af VEGF-proteinet for at undertrykke CNV; der foreligger endnu ingen effektiv behandling for aAMD^6,7.

Flere undersøgelser evaluerede cellebaserede behandlinger for at erstatte anti-VEGF-behandlingen: undersøgelser foretaget af Binder et al., hvor friskhøstede autologe RPE-celler blev transplanteret til patienter med nAMD^8,9,10, viste moderat visuel forbedring, men kun en lille gruppe patienter nåede en endelig synsstyrke høj nok til at muliggøre læsning. For nylig brugte et klinisk fase I-studie et embryonalt stamcelleafledt RPE-plaster til behandling af AMD med lovende resultater; effekt, stabilitet og sikkerhed af RPE-plasteret i op til 12 måneder hos 2 af de 10 patienter, der blev behandlet¹¹. Derudover har flere grupper offentliggjort undersøgelser, hvor autologe RPE-Bruch’s membran-choroid patches blev høstet fra den perifere nethinde og transplanteret til macula^12,13,14; og inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte RPE-patches blev genereret til transplantation¹⁵. For aAMD er antistoffer rettet mod komplementvejen blevet testet i kliniske forsøg^6,16 og et fase I-studie ved hjælp af en enkelt intravitreal injektion af en adeno-associeret viral (AAV) vektor, der koder genet for faktoren CD59 (AAVCAGsCD59) hos patienter med geografisk atrofi (GA) blev afsluttet¹⁷; fase II-studiet startede for nylig og har til formål at rekruttere 132 patienter med avanceret aAMD og at evaluere resultatet ved 2 år efter intervention¹⁸. Endelig har FocuS-studiegruppen startet et fase I/II multicenter klinisk forsøg, der evaluerer sikkerheden, dosisresponset og effekten af en rekombinant ikke-replikerende AAV-vektor, der kodning af en menneskelig komplementfaktor¹⁹.

Primært er målet med en regenerativ AMD-behandling transplantation af funktionelle RPE-celler, som blev beskadiget eller tabt. IPE- og RPE-celler deler imidlertid mange funktionelle og genetiske ligheder (f.eks. fagocytose og retinolmetabolisme), og fordi IPE-celler er mere feaably høstet, er de blevet foreslået som RPE-erstatning²⁰. Selv om det tidligere er blevet påvist, at IPE-celletransplantationen forsinker fotoreceptordegeneration i dyremodeller^21,22 og stabiliserer visuel funktion hos patienter med end-stage nvAMD, blev der ikke observeret nogen signifikant forbedring hos disse patienter²³. Den manglende effekt kan skyldes det lave antal transplanterede celler, og / eller ubalancen af neuroprotektive retinale faktorer. En alternativ tilgang ville være at transplantere transfected pigment epitelceller, der overekspresser neuroprotektive faktorer for at genoprette retinale homøostase, opretholde de resterende RPE-celler og beskytte fotoreceptorer og RGCs mod degeneration. Derfor foreslår vi en ny behandling, der omfatter transplantation af funktionelle RPE- eller IPE-celler, der har gennemgået genteknologi for at udskille neuroprotektive og anti-angiogene proteiner, såsom PEDF, GM-CSF eller insulinlignende vækstfaktorer (IGF’er). Fordelen ved at udvikle og analysere denne fremgangsmåde i flere arter i stedet for at bruge en cellelinje, kun én art eller humant væv er: 1) øget reproducerbarhed og overførbarhed af resultaterne som vist ved talrige undersøgelser realiseret i uafhængige laboratorier og forskellige arter^1,24,25; 2) svine- eller kvægceller er stort ud til rådighed uden at ofre yderligere dyr; 3) tilgængeligheden af især svine- og kvægceller gør det muligt for store testserier at give solide resultater; 4) viden om at isolere, kultur og genetisk modificere celler fra de mest anvendte modeller muliggør in vivo-analyser hos flere arter^24,25,26 og giver således et forbedret risiko-benefit-forhold for de første behandlede patienter; 5) fleksibiliteten i den præsenterede protokol gør det muligt at anvende den i forskellige modeller og eksperimentelle opsætninger og for alle øjencellebaserede behandlinger med og uden genteknologi. I modsætning hertil er alternative teknikker som cellelinjer eller humant væv kun af begrænset overførbarhed og/eller begrænset bortskaffelse. Cellelinjer som ARPE-19 er ideelle til indledende eksperimenter; Lav pigmentering og høj spredning adskiller sig dog betydeligt fra^{primærcellerne 1}. RPE- og IPE-celler, som er isoleret fra humant donorvæv, udgør en værdifuld kilde til in vitro-forsøg, der kan overføres. men vi får humant væv fra en amerikansk-amerikansk Eye Bank betyder, at vævet er mindst to dage gammel (efter enucleation) og kræver en lang og dyr transport, men lokale donorvæv er ikke tilgængelig i tilstrækkelige mængder til en produktiv forskning. Fordelen ved brugen af primære celler bekræftes af flere undersøgelser fra andre grupper^27,28.

Til udvikling af en cellebaseret ikke-viral genterapi ved hjælp af SB100X transposon-systemet til transfecting af primære RPE- og IPE-celler med generne, der koder for PEDF og/eller GM-CSF til behandling af henholdsvis nvAMD og aAMD,^{henholdsvis 29,30,31,32}, etablerede vi først transfektionen af ARPE-19-celler¹ . Dernæst blev isolations- og transfectionprotokollerne etableret i lettilgængelige kvæg- og svin primære celler. Nu er isolation og transfektion af primære RPE- og IPE-celler fra fem forskellige arter blevet etableret, fra små (som mus) til store pattedyr (som kvæg). Det blev bekræftet i primære RPE- og IPE-celler afledt af menneskelige donorøjne³⁰. Den gode fremstillingspraksis (GMP)-kompatibel produktion af ATMP blev valideret ved hjælp af humant donorvæv samt³³. Endelig blev både sikkerheden og effektiviteten af tilgangen vurderet in vivo i tre forskellige arter, for hvilke protokollen er blevet tilpasset: mus, rotte og kanin. I det kliniske set-up vil en irisbiopsi blive høstet fra patienten, og IPE-celler vil blive isoleret og transfected i renrummet, før cellerne vil blive transplanteret subretinally tilbage til den samme patient. Hele processen vil finde sted under en enkelt kirurgisk session, der varer cirka 60 minutter. Udviklingen af behandlingsmetoden og evalueringen af dens effektivitet anmodede om fremragende in vitro- og ex vivo-modeller til at implementere robuste og effektive genleveringsmetoder, analysere effektiviteten af genlevering, terapeutisk proteinproduktion og neuroprotektive virkninger og til at producere celletransplantationer for at teste tilgangen in vivo^{1,24,25,29,30} . Det er værd at nævne, at behandlingen har den etiske godkendelse til et klinisk fase Ib / IIa-forsøg fra den etiske kommission for forskning i Kantonen Genève (nr. 2019-00250), og i øjeblikket indsamles sidste prækliniske data, der anmodes om tilladelse af schweiziske tilsynsmyndigheder, ved hjælp af den præsenterede protokol. I den forbindelse viste prækliniske in vivodata en signifikant reduktion i CNV og fremragende sikkerhed^24,25,31.

Her beskrives isoleringen og kulturen af RPE/IPE-celler fra kvæg, gris, kanin, rotte og mus og brugen af det integrative SB100X transposonsystem kombineret med elektroporation som en effektiv genleveringsmetode. Især blev primære PE-celler overført til at overekspressere PEDF og GM-CSF. Indsamlingen af disse protokoller gør det muligt at udføre in vitro- og in vivo-studierne i alle prækliniske faser af ATMP-udviklingen. Desuden har set-up potentiale til at blive tilpasset andre gener af interesse og sygdomme.

Protocol

De protokoller, hvori dyrene var involveret, blev udført af certificeret personale og efter tilladelse fra det kantonale departement de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale i Genève, Schweiz, og i henhold til ARVO-erklæringen om anvendelse af dyr i oftalmisk og visionsforskning (godkendelse nr. GE/94/17). Voksne sunde Brown Norway rotter, C57BL/6 mus, og New Zealand hvide kaniner blev aflivet af en overdosis af Pentobarbital (150 mg/kg) fortyndet i 0,9% NaCl injicere…

Representative Results

PE isolation fra forskellige pattedyr arterVed hjælp af ovennævnte protokoller blev IPE- og RPE-celler med succes isoleret og kultiveret fra fem forskellige arter. Antallet af celler, der er fremstillet ved hver procedure, afhænger af øjets art og størrelse (tabel 1). Som vist i figur 1, celler viser typisk PE celle morfologi og pigmentering (bortset fra kaninceller vist, afledt af albino New Zealand White (NZW) kaniner). Efter 21 dage efter isolati…

Discussion

Under standardiserede metoder til at isolere og kultur PE celler er afgørende i udviklingen af nye behandlingsmetoder for retinale degenerative sygdomme. Med de protokoller, der præsenteres her, kan PE-celler med succes isoleres fra forskellige arter og dyrkes i lange perioder (indtil nu blev den længste kultur opretholdt i 2 år^1,38); typisk PE-cellemorfologi, pigmentering og funktion blev observeret (Figur 1, <strong class="xfig…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)