Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

Summary

Qui viene presentato un protocollo per isolare e trasfezionare le cellule epiteliali primarie dell’iride e del pigmento retinico da vari mammiferi (topi, ratti, conigli, suini e bovini). Il metodo è ideale per studiare approcci di terapia genica oculare in vari set-up per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all’uomo.

Abstract

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è la causa più frequente di cecità nei pazienti >60 anni, che colpisce circa 30 milioni di persone in tutto il mondo. L’AMD è una malattia multifattoriale influenzata da fattori ambientali e genetici, che portano a compromissione funzionale della retina a causa della degenerazione cellulare epiteliale pigmentata retinica (RPE) seguita dalla degradazione dei fotorecettori. Un trattamento ideale includerebbe il trapianto di cellule RPE sane che secernono fattori neuroprotettivi per prevenire la morte delle cellule RPE e la degenerazione dei fotorecettori. A causa delle somiglianze funzionali e genetiche e della possibilità di una biopsia meno invasiva, il trapianto di cellule epiteliali pigmentate dell’iride (IPE) è stato proposto come sostituto dell’RPE degenerato. La secrezione di fattori neuroprotettivi da parte di un basso numero di cellule trapiantate subretinamente può essere ottenuta mediante trasfezione mediata da trasposoni(SB100X)con geni che codificano per il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF) e / o il fattore stimolante le colonie di macrofagi dei granulociti (GM-CSF). Abbiamo stabilito l’isolamento, la coltura e la trasfezione mediata da SB100Xdi cellule RPE e IPE di varie specie tra cui roditori, maiali e bovini. I globi vengono espiantati e la cornea e la lente vengono rimosse per accedere all’iride e alla retina. Utilizzando una spatola su misura, le celle IPE vengono rimosse dall’iride isolata. Per raccogliere le cellule RPE, può essere necessaria un’incubazione di tripsina, a seconda della specie. Quindi, utilizzando la spatola personalizzata RPE, le celle vengono sospese nel mezzo. Dopo la semina, le cellule vengono monitorate due volte a settimana e, dopo aver raggiunto la confluenza, trasfettate dall’elettroporazione. L’integrazione genica, l’espressione, la secrezione proteica e la funzione sono state confermate da qPCR, WB, ELISA, immunofluorescenza e saggi funzionali. A seconda della specie, 30.000-5 milioni (RPE) e 10.000-1,5 milioni (IPE) di cellule possono essere isolate per occhio. Le cellule geneticamente modificate mostrano una significativa sovraespressione di PEDF/GM-CSF con la capacità di ridurre lo stress ossidativo e offrono un sistema flessibile per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all’uomo per sviluppare approcci di terapia genica oculare.

Introduction

Il nostro gruppo si sta concentrando sullo sviluppo di approcci rigenerativi per il trattamento della degenerazione neuroretinica, cioè AMD, mediante terapia genica non virale basata su RPE e IPE. L’istituzione pre-clinica di tali terapie richiede modelli in vitro trasferibili agli esseri umani. Pertanto, l’obiettivo dello studio qui presentato è quello di fornire protocolli per l’isolamento, la coltura e l’ingegneria genetica delle cellule PRIMARIE RPE e IPE. Il razionale per stabilire l’isolamento delle cellule PE da più specie è quello di confermare in modo robusto la sicurezza e l’efficienza dell’approccio e aumentarne la riproducibilità e la trasferibilità. La linea cellulare RPE umana disponibile ARPE-19 differisce dalle cellule primarie (ad esempio, sono meno pigmentate) ed è, quindi, solo di valore limitato per le analisi pre-cliniche¹. Inoltre, le cellule di mammifero non umane possono essere acquistate a costi inferiori e in quantità maggiori; il tessuto del donatore umano può essere ottenuto da varie banche oculari, ma la disponibilità è limitata e costosa. Infine, i nuovi medicinali per terapie avanzate (ATMP, cioè cellule, tessuti o medicinali per terapia genica) devono essere applicati in almeno due specie diverse prima di essere testati nei pazienti e questi studi in vivo richiedono la preparazione di trapianti di cellule allogeniche.

Le malattie neurodegenerative della retina sono la principale causa di cecità nei paesi industrializzati, comprendendo malattie comuni come l’AMD, così come malattie rare come la retinite pigmentosa, in cui la morte delle cellule retiniche alla fine porta alla cecità. Il danno alle cellule RPE, ai fotorecettori e alle cellule gangliari retiniche (RGC) può in alcuni casi essere rallentato, ma attualmente non sono disponibili terapie curative. Gli ATMP offrono il potenziale per correggere i difetti genetici, integrare geni terapeutici o sostituire le cellule degenerate, consentendo così lo sviluppo di terapie rigenerative e curative per malattie come l’AMD; 13 terapie geniche hanno già ottenuto l’approvazione alla commercializzazione, inclusa una terapia per il trattamento della degenerazione retinica associata alla mutazione RPE65^2,3. Tra gli anziani (>60 anni), ~ 30 milioni di persone in tutto il mondo sono affette da AMD⁴neovascolare (nvAMD) o avascolare (aAMD). Entrambe le forme sono indotte da fattori scatenanti associati all’età tra cui danno ossidativo, compromissione della funzione e perdita di cellule RPE seguita da degradazione dei fotorecettori, tra gli altri (ad esempio alleli di rischio genetico, fumo, ipertensione)^5,6. In nvAMD, la patogenesi è aggravata da uno squilibrio di fattori angiogenici e anti-angiogenici a favore del fattore di crescita endoteliale vascolare angiogenico (VEGF) che induce la neovascolarizzazione coroidale (CNV). Ad oggi, solo nvAMD è curabile con iniezioni intravitreali mensili di inibitori della proteina VEGF per sopprimere il CNV; nessun trattamento efficace è ancora disponibile per aAMD^6,7.

Diversi studi hanno valutato terapie cellulari per sostituire la terapia anti-VEGF: gli studi condotti da Binder et al., in cui cellule RPE autologhe appena raccolte sono state trapiantate in pazienti con nAMD^8,9,10,hanno mostrato un moderato miglioramento visivo, ma solo un piccolo gruppo di pazienti ha raggiunto un’acuità visiva finale abbastanza alta da consentire la lettura. Recentemente, uno studio clinico di fase I ha utilizzato un cerotto RPE derivato da cellule staminali embrionali per trattare l’AMD con risultati promettenti; vale a dire, efficacia, stabilità e sicurezza del cerotto RPE per un massimo di 12 mesi in 2 dei 10 pazienti trattati¹¹. Inoltre, diversi gruppi hanno pubblicato studi in cui i cerotti autologhi RPE-Bruch membrana-coroide sono stati prelevati dalla retina periferica e trapiantati nella macula^12,13,14; e per il trapianto sono stati generati cerotti RPE derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)¹⁵. Per l’aAMD, gli anticorpi mirati alla via del complemento sono stati testati in studi clinici^6,16 e uno studio di fase I utilizzando una singola iniezione intravitreale di un vettore virale adeno-associato (AAV) che codifica il gene per il fattore CD59 (AAVCAGsCD59) in pazienti con atrofia geografica (GA) è stato completato¹⁷; lo studio di fase II è stato recentemente avviato e mira a reclutare 132 pazienti con aAMD avanzata e a valutare l’esito a 2 anni dopo l’intervento^18. Infine, il gruppo di studio FocuS ha avviato uno studio clinico multicentrico di fase I/II che valuta la sicurezza, la risposta alla dose e l’efficacia di un vettore AAV ricombinante non replicante che codifica un fattore del complemento umano^19.

In primo luogo, l’obiettivo di una terapia rigenerativa AMD è il trapianto di cellule RPE funzionali, che sono state danneggiate o perse. Tuttavia, le cellule IPE e RPE condividono molte somiglianze funzionali e genetiche (ad esempio, fagocitosi e metabolismo del retinolo) e, poiché le cellule IPE sono raccolte in modo più fattibile, sono state proposte come sostituto RPE²⁰. Anche se è stato precedentemente dimostrato che il trapianto di cellule IPE ritarda la degenerazione dei fotorecettori nei modelli animali^21,22 e stabilizza la funzione visiva nei pazienti con nvAMD allo stadio finale, non è stato osservato alcun miglioramento significativo in questi^{pazienti 23}. La mancanza di efficacia può essere dovuta al basso numero di cellule trapiantate e/o allo squilibrio dei fattori retinici neuroprotettivi. Un approccio alternativo sarebbe quello di trapiantare cellule epiteliali pigmentate trasfettate che sovraesprimono fattori neuroprotettivi per ripristinare l’omeostasi retinica, mantenere le cellule RPE rimanenti e proteggere i fotorecettori e gli RGC dalla degenerazione. Di conseguenza, proponiamo una nuova terapia che comprende il trapianto di cellule funzionali RPE o IPE che sono state sottoposte a ingegneria genetica per secernere proteine neuroprotettive e anti-angiogeniche, come PEDF, GM-CSF o fattori di crescita insulino-simili (IGF). Il vantaggio di sviluppare e analizzare questo approccio in diverse specie invece di utilizzare una linea cellulare, una sola specie, o tessuto umano è: 1) aumentata riproducibilità e trasferibilità dei risultati come dimostrato da numerosi studi realizzati in laboratori indipendenti e diverse specie^1,24,25; 2) le cellule suine o bovine sono fattibilmente usa e getta senza il sacrificio di altri animali; 3) la disponibilità soprattutto di cellule suine e bovine consente a grandi serie di test di produrre risultati robusti; 4) la conoscenza di isolare, colturare e modificare geneticamente le cellule dai modelli maggiormente utilizzati consente analisi in vivo in più specie^24,25,26 e offre quindi un migliore rapporto rischio-beneficio per i primi pazienti trattati; 5) la flessibilità del protocollo presentato ne consente l’utilizzo in vari modelli e set up sperimentali e per tutte le terapie cellulari oculari con e senza ingegneria genetica. Al contrario, tecniche alternative come le linee cellulari o il tessuto umano sono solo di limitata trasferibilità e/ o disponibilità limitata. Le linee cellulari come l’ARPE-19 sono ideali per esperimenti preliminari; tuttavia, la bassa pigmentazione e l’alta proliferazione differiscono significativamente dalle cellule primarie¹. Le cellule RPE e IPE, isolate dal tessuto umano del donatore, offrono una preziosa fonte per esperimenti in vitro trasferibili; tuttavia, otteniamo tessuto umano da una Banca degli occhi statunitense-americana, il che significa che il tessuto ha almeno due giorni (dopo l’enucleazione) e richiede un trasporto lungo e costoso, ma il tessuto del donatore locale non è disponibile in quantità sufficienti per una ricerca produttiva. Il vantaggio dell’uso di cellule primarie è confermato da molteplici studi di altri gruppi^27,28.

Per lo sviluppo di una terapia genica non virale a base cellulare utilizzando il sistema di trasposoni SB100X per trasfettare cellule primarie RPE e IPE con i geni che codificano per PEDF e/o GM-CSF per trattare nvAMD e aAMD, rispettivamente^29,30,31,32,abbiamo prima stabilito la trasfezione delle cellule ARPE-19¹ . Successivamente, i protocolli di isolamento e trasfezione sono stati stabiliti in cellule primarie bovine e sucine facilmente accessibili. Ora, è stato stabilito l’isolamento e la trasfezione di cellule primarie RPE e IPE da cinque diverse specie, da piccoli (come topi) a grandi mammiferi (come bovini). È stato confermato in cellule primarie RPE e IPE derivate da occhi di donatori umani³⁰. La produzione conforme alle buone pratiche di fabbricazione (GMP) dell’ATMP è stata convalidata utilizzando anche tessuto di donatore umano³³. Infine, sia la sicurezza che l’efficienza dell’approccio sono state valutate in vivo in tre diverse specie per le quali il protocollo è stato adattato: topo, ratto e coniglio. Nel set-up clinico, una biopsia dell’iride sarà prelevata dal paziente e le cellule IPE saranno isolate e trasfettate nella camera bianca, prima che le cellule vengano trapiantate subretinamente nello stesso paziente. L’intero processo si svolgerà durante una singola sessione chirurgica della durata di circa 60 minuti. Lo sviluppo dell’approccio terapeutico e la valutazione della sua efficienza hanno richiesto eccellenti modelli in vitro ed ex vivo per implementare metodi di consegna genica robusti ed efficienti, per analizzare l’efficienza della consegna genica, la produzione terapeutica di proteine e gli effetti neuroprotettivi e per produrre trapianti di cellule per testare l’approccio in vivo^{1,24,25,29,30} . Vale la pena ricordare che la terapia ha l’approvazione etica per uno studio clinico di fase Ib/IIa da parte della commissione etica per la ricerca del Cantone di Ginevra (n. 2019-00250) e attualmente gli ultimi dati pre-clinici richiesti per l’autorizzazione dalle autorità di regolamentazione svizzere sono raccolti utilizzando il protocollo presentato. A questo proposito, i dati pre-clinici in vivo hanno dimostrato una significativa riduzione del CNV e un’ottima sicurezza^24,25,31.

Qui viene descritto l’isolamento e la coltura di cellule RPE / IPE da bovini, suini, conigli, ratti e topi e l’uso del sistema di trasposone integrativo SB100X combinato con l’elettroporazione come metodo efficiente di consegna genica. In particolare, le cellule PE primarie sono state trasfettate per sovraesprimere PEDF e GM-CSF. La raccolta di questi protocolli consente di eseguire gli studi in vitro e in vivo in tutte le fasi pre-cliniche dello sviluppo di ATMP. Inoltre, il set-up ha il potenziale per essere adattato ad altri geni di interesse e malattie.

Protocol

I protocolli in cui gli animali sono stati coinvolti sono stati eseguiti da personale certificato e previa autorizzazione del Dipartimento cantonale della sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale di Ginevra, Svizzera, e secondo la Dichiarazione ARVO per l’uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva (approvazione n. GE/94/17). Ratti adulti sani brown norway, topi C57BL/6 e conigli bianchi neozelandesi sono stati eutanasizzati da un sovradosaggio di Pentobarbital (150 mg/…

Representative Results

Isolamento dell’EP da diverse specie di mammiferiUtilizzando i protocolli di cui sopra, le cellule IPE e RPE sono state isolate e coltivate con successo da cinque specie diverse. Il numero di cellule ottenute da ciascuna procedura dipende dalla specie e dalle dimensioni dell’occhio (Tabella 1). Come mostrato nella Figura 1,le cellule mostrano la morfologia e la pigmentazione tipiche delle cellule PE (ad eccezione delle cellule di coniglio mostrate, deriv…

Discussion

Avere metodi standardizzati per isolare e colturare le cellule PE è fondamentale nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per le malattie degenerative della retina. Con i protocolli qui presentati, le cellule PE possono essere isolate con successo da diverse specie e coltivate per lunghi periodi (fino ad ora, la coltura più lunga è stata mantenuta per 2 anni^1,38); è stata osservata la morfologia, la pigmentazione e la funzione tipiche delle cellule PE (<s…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)