非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

Summary

ここでは、種々の哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ)から一次虹彩および網膜色素上皮細胞を単離およびトランスフェクトするプロトコルが提示される。この方法は、ヒトに移管可能なエクスビボ分析およびインビボ研究のための様々なセットアップにおける眼遺伝子治療アプローチを研究するのに理想的である。

Abstract

加齢黄斑変性症(AMD)は、患者>60年の失明の最も頻繁な原因であり、世界中で約3000万人に影響を及ぼします。AMDは環境や遺伝的要因の影響を受ける多因子性疾患であり、網膜色素上皮(RPE)細胞の変性に続いて感光体分解による網膜の機能障害を引き起こします。理想的な治療法には、RPE細胞死および感光体変性を防ぐために神経保護因子を分泌する健康なRPE細胞の移植が含まれる。機能的および遺伝的類似性と、より侵襲性の低い生検の可能性のために、虹彩色素上皮(IPE)細胞の移植が退化したRPEの代用として提案された。低い数の網膜移植細胞による神経保護因子の分泌は、睡眠美容(SB100X)、色素上皮由来因子(PEDF)および/または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をコードする遺伝子を用いたトランスポゾン媒介性トランスフェクションによって達成することができる。げっ歯類、豚、牛など様々な種のRPE細胞とIPE細胞の分離、培養、SB100X媒介トランスフェクションを確立しました。地球儀は植え付けされ、角膜とレンズは虹彩と眼炎にアクセスするために除去される。カスタムメイドのヘラを使用して、IPE細胞は単離された虹彩から除去される。RPE細胞を収穫するには、種に応じてトリプシンインキュベーションが必要になることがあります。次いで、RPEカスタマイズされたヘラを使用して、細胞を培地に懸濁させる。播種後、細胞を週2回監視し、合流に達した後、エレクトロポレーションによってトランスフェクトする。遺伝子の一体化、発現、タンパク質分泌、および機能は、qPCR、WB、ELISA、免疫蛍光、および機能アッセイにより確認された。種に応じて、30,000-5百万(RPE)および10,000-150万(IPE)細胞を1眼で単離することができます。遺伝子組み換え細胞は、酸化ストレスを軽減する能力を持つ重要なPEDF/GM-CSF過剰発現を示し、遺伝子治療アプローチを開発するためにヒトに移入可能なex vivo分析および生体内研究のための柔軟なシステムを提供する。

Introduction

我々のグループは、RPEおよびIPEベースの非ウイルス遺伝子治療による神経レチン系変性、すなわちAMDを治療するための再生アプローチの開発に焦点を当てている。このような治療法の前臨床確立は、ヒトに移管可能な 体外モデルで 必要とされる。したがって、ここで示す研究の目的は、一次RPEおよびIPE細胞の分離、培養、および遺伝子工学のためのプロトコルを提供することです。複数の種からPE細胞を単離する根拠は、アプローチの安全性と効率を強固に確認し、その再現性と移動性を高めることです。利用可能なヒトRPE細胞株ARPE-19は、一次細胞とは異なり(例えば、それらは、あまり色素沈着性)であり、したがって、臨床前の分析^のための限られた値の1。さらに、非ヒト哺乳類細胞は、より少ないコストで、より大きな量で購入することができます。ヒトドナー組織は様々なアイバンクから得ることができますが、入手可能性は限られており、高価です。最後に、新しい先端治療薬品(ATMP、すなわち、細胞、組織、または遺伝子治療薬品)は、患者で試験される前に少なくとも2つの異なる種で適用する必要があり、これらの インビボ 研究は、同種細胞移植の準備を要求する。

網膜神経変性疾患は、AMDのような一般的な疾患だけでなく、網膜細胞死が最終的に失明につながる網膜色素変性症のような稀な疾患を含む先進国の失明の主な原因である。RPE細胞、光受容体、およびRetinal神経節細胞(RGC)の損傷は、場合によっては遅くなる可能性がありますが、現在のところ治療法はありません。ATMPは、遺伝子欠損を修正したり、治療遺伝子を統合したり、脱退細胞を置き換えたりする可能性を提供し、AMDなどの疾患に対する再生および治癒療法の開発を可能にする。13遺伝子治療は、RPE65変異関連のレ^チン性変性^2、3を治療するための治療法を含むマーケティング承認を既に得ている。高齢者(>60歳)の間で、世界中で約3,000万人が新血管(nvAMD)または血管(aAMD)AMD⁴の影響を受けます。両方の形態は、酸化的損傷、機能障害およびRPE細胞の喪失を含む年齢関連の誘発によって誘発され、その後に光受容体分解が続き、とりわけ(例えば遺伝的リスク対立遺伝子、喫煙、高血圧^)5、6。nvAMDでは、病因は脈絡膜新生血管形成を誘導する血管形成血管内皮成長因子(VEGF)を支持する血管新生および抗血管新生因子の不均衡によって悪化する。現在までに、NVAMDだけが、CNVを抑制するためにVEGFタンパク質の阻害剤の毎月のビトリアル内注射によって治療可能である。aAMD^6,7に対する有効な治療法はまだありません。

いくつかの研究は、抗VEGF療法に代わる細胞ベースの治療法を評価した:バインダーらによって行われた研究は、採取したばかりの自家RPE細胞がnAMD^8、9、10の患者に移植されたが、適度な視力改善を示したが、患者の小さなグループだけが読み取りを可能にするのに十分な高い最終的な視力に達した。最近、第I相臨床試験では、胚性幹細胞由来RPEパッチを使用してAMDを有望な結果で治療しました。すなわち^、11を治療した10人の患者のうち2人で最大12ヶ月間のRPEパッチの有効性、安定性、安全性。さらに、いくつかのグループは、自家RPE-ブルッフの膜-脈絡膜パッチが末梢性のレチナから収穫され、黄斑^12、13、14に移植された研究を発表している。そして、移植用に誘導多能性幹細胞(iPSC)由来のRPEパッチが生成された^。aAMDの場合、補体経路を標的とする抗体は、臨床試験^6、16および地理的萎縮(GA)を有する患者における因子CD59(AAVCAGsCD59)の遺伝子をコードするアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターの単一のウイルス内注射を用いた第I相試験で試験された^。フェーズIIの研究は最近始まり、高度なaAMDを有する132人の患者を募集し、介入後2年間で結果を評価することを目指しています¹⁸.最後に、FocuS研究グループは、ヒト補体因子¹⁹をコードする組換え非複製AAVベクターの安全性、用量応答および有効性を評価する第I/II多施設臨床試験を開始した。

主に、再生AMD療法の目的は、損傷または失われた機能的RPE細胞の移植である。しかし、IPE細胞とRPE細胞は多くの機能的および遺伝的類似性(例えば、貪食およびレチノール代謝)を共有し、かつIPE細胞がより実現可能に収穫されるため、RPE代替²⁰として提案されている。IPE細胞移植が動物モデル^21,22における感光体変性を遅らせるということは以前に実証されているが^、末期nvAMD患者では視覚機能を安定化させるが、これらの患者²³では有意な改善は認められなかった。有効性の欠如は、移植細胞の数が少ないこと、および/または神経保護性の疾患の不均衡に起因する可能性があります。別のアプローチは、網膜ホメオスタシスを回復させ、残りのRPE細胞を維持し、変性から光受容体とRGCを保護するために神経保護因子を過剰発現するトランスフェクト色素上皮細胞を移植することです。その結果、PEDF、GM-CSF、インスリン様成長因子(IMF)などの神経保護タンパク質および抗血管新生タンパク質を分泌するために遺伝子工学を受けた機能RPEまたはIPE細胞の移植を含む新しい治療法を提案する。細胞株を使用する代わりに、いくつかの種、1つの種、またはヒト組織でこのアプローチを開発し分析する利点は:1)独立した実験室および異なる種^1、24、25で実現された多数の研究によって示されるように結果の再現性および伝達可能性の増加;2)豚やウシの細胞は、追加の動物の犠牲なしで実現可能に使い捨て;3)特に豚やウシの細胞の可用性は、堅牢な結果を生成するために大規模なテストシリーズを可能にします。4)大部分が使用されるモデルから細胞を単離、培養、遺伝的に改変する知識は、複数の種^24、25、26で生体内解析を可能にし^、最初に治療された患者に対して改善されたリスクベネフィット比を提供する。5)提示されたプロトコルの柔軟性は、様々なモデルや実験的なセットアップで、および遺伝子工学の有無にかかわらずすべての眼球ベースの治療法でその使用を可能にする。対照的に、細胞株またはヒト組織としての代替技術は、限られた転写性および/または限定的な解位性のみのものである。ARPE-19のような細胞株は予備実験に理想的である;しかし、低色素沈着と高増殖は、初等細胞¹とは大きく異なる。ヒトドナー組織から分離されたRPEおよびIPE細胞は、転写可能なインビトロ実験のための貴重な供給源を提供する。しかし、米国系アメリカ人の眼バンクからヒト組織を取得すると、組織は少なくとも2日齢(核分裂後)であり、長く高価な輸送が必要ですが、局所ドナー組織は生産的な研究のために十分な量では利用できません。原細胞の使用の利点は、他のグループ^27,28からの複数の研究によって確認される。

PEDFおよび/またはGM-CSFをコードする遺伝子を用いて一次RPEおよび/またはGM-CSFをコードする遺伝子を用いたSB100Xトランスポゾンシステムを用いた細胞ベースの非ウイルス遺伝子治療の開発のために、それぞれ29、30、31、32、ARPE-19細胞のトランスフェクションを確立しました^。.次に、容易にアクセス可能なウシおよびブタの原発細胞に単離およびトランスフェクションプロトコルが確立された。現在、小さな(マウスとして)から大型哺乳類(牛)まで、5種の異なる種から一次RPE細胞とIPE細胞の単離とトランスフェクションが確立されました。ヒトドナー眼³⁰に由来する一次RPEおよびIPE細胞で確認した。ATMPの良い製造慣行(GMP)準拠の生産は、人間のドナー組織を使用して検証されました³³.最後に、アプローチの安全性と効率の両方を、プロトコルが適応された3つの異なる種(マウス、ラット、ウサギ)でin vivoで評価しました。臨床セットアップでは、虹彩生検が患者から採取され、IPE細胞はクリーンルームで単離され、トランスフェクションされ、細胞が同じ患者に下無しに移植される。プロセス全体は、約60分間続く単一の外科セッション中に行われます。治療アプローチの開発とその効率の評価は、堅牢で効率的な遺伝子送達方法を実装し、遺伝子送達の効率を分析し、治療タンパク質産生および神経保護効果を分析し、生体内1、24、25、29、30のアプローチをテストするための細胞移植を行うために、優れたin vitroおよびex vivoモデル^を要求しました^。.この療法は、ジュネーブ州(2019-00250)の研究のための倫理委員会からの臨床段階Ib/IIa試験の倫理的承認を有し、現在、スイスの規制当局によって承認のために要求された最後の前臨床データが提示されたプロトコルを使用して収集されることを言及する価値があります。この点に関して、生体内データの前臨床はCNVの有意な減少および優秀な安全24、25、31を示した。

ここでは、ウシ、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスからのRPE/IPE細胞の単離および培養、および効率的な遺伝子送達方法としてエレクトロポレーションと組み合わせた統合型 SB100X トランスポゾンシステムの使用について説明する。特に、原発PE細胞は、過剰発現PEDFおよびGM-CSFにトランスフェクションした。これらのプロトコルのコレクションはATMPの開発のすべての前臨床段階で実施される in vitro および in vivo の研究を可能にする。さらに、セットアップは、関心や疾患の他の遺伝子に適応する可能性を有する。

Protocol

動物が関与したプロトコルは、認定された人員によって行われ、カントナル・デ・ラ・セクリテ、ド・ランプロイ・エ・ド・ラ・サンテ(DSES)、スイスのジュネーブのドメーヌ・ド・ラルエクスペリメンテーション動物、およびオフタルム・ビジョン研究における動物の使用に関するARVO声明(承認なし)によって承認された。GE/94/17)。成人の健康なブラウンノルウェーラット、C57BL/6マウス、ニュ…

Representative Results

異種哺乳類からのPE分離前述のプロトコルを用いて、IPE細胞とRPE細胞を5種分から正常に単離し、培養した。各手順から得られる細胞の数は、眼の種や大きさに依存する(表1)。図1に示すように、細胞は典型的なPE細胞の形態および色素沈着を示す(示されたウサギ細胞を除く、アルビノニュージーランドホワイト(NZW)ウサギ由来である)。21日後?…

Discussion

PE細胞を単離し培養するための標準化された方法を持つことは、レチン性変性疾患に対する新しい治療法の開発の基本です。ここで提示されるプロトコルでは、PE細胞は異なる種から正常に分離され、長期間培養することができます(これまで、最長の培養は2年間^1、38年維持されていました)。典型的なPE細胞形態、色素沈着および機能が観察された(<…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)