Isolering, kultur och genteknik av däggdjurs primära pigment epitelceller för icke-viral genterapi

Summary

Här presenteras ett protokoll för att isolera och transfektera primära iris och retinal pigment epitelial celler från olika däggdjur (möss, råtta, kanin, gris och nötkreatur). Metoden är idealisk för att studera okulära genterapimetoder i olika upplägg för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor.

Abstract

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den vanligaste orsaken till blindhet hos patienter >60 år, vilket påverkar ~ 30 miljoner människor över hela världen. AMD är en multifaktoriell sjukdom som påverkas av miljömässiga och genetiska faktorer, som leder till funktionella nedskrivningar av näthinnan på grund av att retinal pigment epitelial (RPE) cell degeneration följt av photoreceptor nedbrytning. En idealisk behandling skulle omfatta transplantation av friska RPE celler utsöndrar neuroprotektiva faktorer för att förhindra RPE cell död och photoreceptor degeneration. På grund av funktionella och genetiska likheter och möjligheten till en mindre invasiv biopsi, föreslogs transplantation av iris pigment epitelial (IPE) celler som ersättning för de urartade RPE. Utsöndring av neuroprotektiva faktorer med ett lågt antal subretinally transplanterade celler kan uppnås genom Törnrosa (SB100X) transposonmedierad transfektion med gener som kodar för pigmentet epitel-härledd faktor (PEDF) och/eller granulocyt makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF). Vi etablerade isolering, kultur och SB100X-medieradtransfektion av RPE- och IPE-celler från olika arter inklusive gnagare, grisar och nötkreatur. Jordglober explanteras och hornhinnan och linsen avlägsnas för att komma åt iris och näthinnan. Med hjälp av en specialtillverkad spatel avlägsnas IPE-celler från den isolerade iris. För att skörda RPE-celler kan en trypsininkubation krävas, beroende på arten. Sedan, med hjälp av RPE-anpassad spatel, suspenderas cellerna i medium. Efter sådd övervakas cellerna två gånger i veckan och, efter att ha nått sammanflöde, transfected av elektroporation. Gen integration, uttryck, protein utsöndring och funktion bekräftades av qPCR, WB, ELISA, immunofluorescens och funktionella analyser. Beroende på arten kan 30 000-5 miljoner (RPE) och 10 000-1,5 miljoner (IPE) celler isoleras per öga. Genetiskt modifierade celler visar betydande PEDF/GM-CSF överuttryck med kapacitet att minska oxidativ stress och erbjuder ett flexibelt system för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor för att utveckla okulära genterapimetoder.

Introduction

Vår grupp fokuserar på utveckling av regenerativa metoder för att behandla neuroretinal degeneration, det vill säga AMD, genom RPE- och IPE-baserad icke-viral genterapi. Den prekliniska etableringen av sådana terapier kräver in vitro-modeller som kan överföras till människor. Således är målet med studien som presenteras här att leverera protokoll för isolering, kultur och genteknik av primära RPE- och IPE-celler. Motiveringen för att fastställa isoleringen av PE-celler från flera arter är att på ett robust sätt bekräfta säkerheten och effektiviteten i tillvägagångssättet och öka dess reproducerbarhet och överförbarhet. Den tillgängliga humana RPE-cellinjen ARPE-19 skiljer sig från primärceller (t.ex. de är mindre pigmenterade) och är därför endast av begränsat värde för prekliniska analyser¹. Dessutom kan icke-mänskliga däggdjursceller köpas för mindre kostnad och i större mängder; mänsklig donatorvävnad kan erhållas från olika eyebanks, men tillgängligheten är begränsad och dyr. Slutligen måste nya läkemedel för avancerad terapi (ATMP, dvs. cell-, vävnads- eller genterapiläkemedel) appliceras på minst två olika arter innan de testas på patienter och dessa in vivo-studier kräver att allogena celltransplantationer förbereds.

Retinal neurodegenerativa sjukdomar är den ledande orsaken till blindhet i industrialiserade länder, bestående av vanliga sjukdomar som AMD, liksom sällsynta sjukdomar som retinitis pigmentosa, där retinalcellens död så småningom leder till blindhet. RPE-celler, fotoreceptor och retinal ganglion celler (RGC) skador kan i vissa fall bromsas, men det finns för närvarande inga botande terapier tillgängliga. ATMPs erbjuder potential att korrigera gendefekter, integrera terapeutiska gener eller ersätta degenererade celler, vilket möjliggör utveckling av regenerativa och botande terapier för sjukdomar som AMD; 13 genterapier har redan fått godkännande för försäljning inklusive en behandling för att behandla RPE65 mutationsassocierad retinal degeneration^2,3. Bland äldre vuxna (>60 år) påverkas ~ 30 miljoner människor över hela världen av antingen neovaskulära (nvAMD) eller avascular (aAMD) AMD⁴. Båda formerna framkallas av åldersrelaterade utlösare inklusive oxidativ skada, funktionsnedsättning och förlust av RPE-celler följt av fotoreceptornedbrytning, bland annat (t.ex. genetiska risk alleler, rökning, högt blodtryck)^5,6. I nvAMD förvärras patogenesen av en obalans av angiogena och anti-angiogena faktorer till förmån för den angiogena vaskulär endotel tillväxtfaktorn (VEGF) som inducerar choroidal neovascularization (CNV). Hittills kan endast nvAMD behandlas med månatliga intravitreala injektioner av hämmare av VEGF-proteinet för att undertrycka CNV; ingen effektiv behandling ännu är tillgänglig för aAMD^6,7.

Flera studier utvärderade cellbaserade terapier för att ersätta anti-VEGF-behandlingen: studier gjorda av Binder et al., där nyskördade autologa RPE-celler transplanterades till patienter med nAMD^8,9,10, visade måttlig visuell förbättring, men endast en liten grupp patienter nådde en slutlig synskärpa tillräckligt hög för att möjliggöra läsning. Nyligen använde en klinisk fas I-studie ett embryonalt stamcellsbaserat RPE-plåster för att behandla AMD med lovande resultat; RPE-plåstrets effekt, stabilitet och säkerhet i upp till 12 månader hos 2 av de 10 behandlade patienterna¹¹. Dessutom har flera grupper publicerat studier där autologa RPE-Bruchs membran-choroid fläckar skördades från den perifera näthinnan och transplanterades till makula^12,13,14; och inducerad pluripotent stamcell (iPSC)-härledda RPE plåster genererades för transplantation^15. För aAMD har antikroppar riktade mot komplementvägen testats i kliniska prövningar^6,16 och en fas I-studie med en enda intravitreal injektion av en adenoassocierad virusvektor (AAV) som kodar genen för faktorn CD59 (AAVCAGsCD59) hos patienter med geografisk atrofi (GA) slutfördes^17; fas II-studien har nyligen påbörjats och syftar till att rekrytera 132 patienter med avancerad aAMD och att utvärdera utfallet vid 2 år efter intervention¹⁸. Slutligen har FocuS-studiegruppen inlett en klinisk fas I/II-studie med multicenter som utvärderar säkerheten, dosresponsen och effekten hos en rekombinant icke-replikerande AAV-vektor som kodar för ett mänskligt komplementfaktor¹⁹.

I första hand är målet med en regenerativ AMD-terapi transplantation av funktionella RPE-celler, som skadades eller förlorades. IPE- och RPE-celler delar dock många funktionella och genetiska likheter (t.ex. fagocytos och retinolmetabolism), och eftersom IPE-celler är mer genomförbara skördade har de föreslagits som ett RPE-substitut²⁰. Även om det tidigare har visats att IPE-celltransplantationen fördröjer fotoreceptordegeneration i djurmodeller^21,22 och stabiliserar den visuella funktionen hos patienter med slutfas nvAMD, observerades ingen signifikant förbättring hos dessa patienter²³. Bristen på effekt kan bero på det låga antalet transplanterade celler och/eller obalansen av neuroprotektiva näthinnefaktorer. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att transplantera transfected pigment epitelial celler som överuttryck neuroprotektiva faktorer för att återställa retinal homeostas, upprätthålla återstående RPE celler och skydda photoreceptors och RGCs från degeneration. Följaktligen föreslår vi en ny terapi som omfattar transplantation av funktionella RPE- eller IPE-celler som har genomgått genteknik för att utsöndra neuroprotektiva och anti-angiogena proteiner, såsom PEDF, GM-CSF eller insulinliknande tillväxtfaktorer (IGF). Fördelen med att utveckla och analysera detta tillvägagångssätt hos flera arter istället för att använda en cellinje, endast en art eller mänsklig vävnad är: 1) ökad reproducerbarhet och överförbarhet av resultaten som framgår av många studier som realiseras i oberoende laboratorier och olika arter^1,24,25; 2) Gris- eller nötkreatursceller är möjliga engångsceller utan att ytterligare djur offras. 3) Tillgången till särskilt svin- och nötkreatursceller gör det möjligt för stora testserier att ge robusta resultat. 4) Kunskapen om att isolera, odla och genetiskt modifiera celler från de mest använda modellerna möjliggör in vivo-analyser hos flera arter^24,25,26 och erbjuder därmed ett förbättrat risk-nyttoförhållande för de första behandlade patienterna. 5) Flexibiliteten i det protokoll som presenteras gör det möjligt att använda det i olika modeller och experimentella upplägg och för alla okulära cellbaserade terapier med och utan genteknik. Alternativa tekniker som cellinjer eller mänsklig vävnad är däremot endast av begränsad överförbarhet och/eller begränsad disposabilitet. Cellinjer som ARPE-19 är idealiska för preliminära experiment; Låg pigmentering och hög spridning skiljer sig dock avsevärt från primärcellerna¹. RPE- och IPE-celler, som är isolerade från mänsklig donatorvävnad, erbjuder en värdefull källa för överförbara in vitro-experiment. Vi får dock mänsklig vävnad från en amerikansk-amerikansk ögonbank vilket innebär att vävnaden är minst två dagar gammal (efter enucleation) och kräver en lång och dyr transport, men lokal donatorvävnad är inte tillgänglig i tillräckliga mängder för en produktiv forskning. Fördelen med användning av primärceller bekräftas av flera studier från andra grupper^27,28.

För utveckling av en cellbaserad icke-viral genterapi med hjälp av SB100X transposonsystem för transfektering av primära RPE- och IPE-celler med generna som kodar för PEDF och/eller GM-CSF för att behandla nvAMD respektive aAMD, respektive^29,30,31,32,fastställde vi först transfektionen av ARPE-19 celler¹ . Därefter fastställdes isolerings- och transfektion protokollen i lättillgängliga bovin och svin primära celler. Nu har isolering och transfektion av primära RPE- och IPE-celler från fem olika arter etablerats, från små (som mus) till stora däggdjur (som nötkreatur). Det bekräftades i primära RPE- och IPE-celler som härrör från mänskliga donatorögon³⁰. Produktionen av god tillverkningssed (GMP) av ATMP validerades med hjälp av mänsklig donatorvävnad samt³³. Slutligen bedömdes både säkerhet och effektivitet i tillvägagångssättet in vivo i tre olika arter för vilka protokollet har anpassats: mus, råtta och kanin. I den kliniska installationen kommer en irisbiopsi att skördas från patienten och IPE-celler kommer att isoleras och transfekteras i renrummet, innan cellerna transplanteras subretinally tillbaka till samma patient. Hela processen kommer att ske under en enda kirurgisk session som varar cirka 60 minuter. Utvecklingen av behandlingsmetoden och utvärderingen av dess effektivitet begärde utmärkta in vitro- och ex vivo-modeller för att implementera robusta och effektiva genleveransmetoder, analysera effektiviteten hos genleverans, terapeutisk proteinproduktion och neuroprotektiva effekter och för att producera celltransplantationer för att testa tillvägagångssättet in vivo^{1,24,25,29,30} . Det är värt att nämna att behandlingen har det etiska godkännandet för en klinisk fas Ib/ IIa-studie från den etiska kommissionen för forskning i kantonen Genève (nr 2019-00250) och för närvarande sista prekliniska data som begärts för godkännande av schweiziska tillsynsmyndigheter samlas in med hjälp av det presenterade protokollet. I detta avseende visade prekliniska in vivo-data en signifikant minskning av CNV och utmärkt säkerhet^24,25,31.

Här beskrivs isoleringen och kulturen av RPE/IPE-celler från nötkreatur, gris, kanin, råtta och mus och användningen av det integrativa SB100X transposon-systemet i kombination med elektroporation som en effektiv genleveransmetod. Särskilt primära PE celler transfected för att överuttryck PEDF och GM-CSF. Insamlingen av dessa protokoll gör det möjligt att genomföra in vitro- och in vivo-studierna i alla prekliniska faser av ATMP-utveckling. Dessutom har upplägget potential att anpassas till andra gener av intresse och sjukdomar.

Protocol

De protokoll i vilka djur var inblandade utfördes av certifierad personal och efter godkännande av det kantonala Département de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale i Genève, Schweiz, och enligt ARVO-uttalandet om användning av djur i oftalmisk forskning och visionsforskning (godkännande nr. GE/94/17). Vuxna friska bruna norge råttor, C57BL/6 möss och Nya Zeeland vita kaniner avlivades genom en överdos av Pentobarbital (150 mg/kg) utspädd i 0,9% NaCl injiceras…

Representative Results

PE isolering från olika däggdjursarterMed hjälp av ovannämnda protokoll isolerades IPE- och RPE-celler framgångsrikt från fem olika arter. Antalet celler som erhålls från varje förfarande beror på ögats art och storlek(tabell 1). Som visas i figur 1visar cellerna typisk PE-cellmorfologi och pigmentering (med undantag för kaninceller som visas, härledda från albino Nya Zeelands vita (NZW) kaniner). Vid 21 dagar efter isoleringen är cellerna…

Discussion

Att ha standardiserade metoder för att isolera och odla PE-celler är grundläggande för att utveckla nya terapimetoder för retinala degenerativa sjukdomar. Med de protokoll som presenteras här kan PE-celler framgångsrikt isoleras från olika arter och odlas under långa perioder (hittills har den längsta kulturen upprätthållits i 2 år^1,38); typisk PE-cellmorfologi, pigmentering och funktion observerades (figur 1, <strong cl…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)