Summary
Detaljerede instruktioner leveres til at bygge et open source, modulært fluormeter, der er kompatibelt med mange billige varmeapparater til at udføre realtid, kvantitativ isotermisk nukleinsyreforstærkning.
Abstract
Traditionelle metoder til påvisning og kvantificering af nukleinsyrer er afhængige af polymerasekædereaktion (PCR) og kræver brug af dyre termocyclere med integreret fluorescensdetektion af ampliconer. Isotermiske nukleinsyreforstærkningsteknologier eliminerer behovet for termisk cykling; Der er dog stadig behov for fluorescensbaseret påvisning af produkter for at opnå kvantitative resultater i realtid. Flere bærbare isotermiske varmeapparater med integreret fluorescensdetektering er nu kommercielt tilgængelige; Omkostningerne ved disse enheder er dog fortsat en væsentlig hindring for udbredt anvendelse i ressourcebegrænsede indstillinger. Beskrevet her er en protokol for design og samling af et modulært, billigt fluormeter konstrueret af off-the-shelf komponenter. Vedlagt et kompakt 3D-printet hus er fluormeteret designet til at blive placeret oven på en kommercielt tilgængelig varmeblok, der holder et PCR-rør. Det fluormeter, der er beskrevet her, blev optimeret til at detektere fluorescein isothiocyanat (FITC) farvestof, men systemet kan ændres til brug med farvestoffer, der almindeligvis anvendes som reportere i realtid nukleinsyreforstærkningsreaktioner. Systemets kliniske anvendelighed demonstreres ved at udføre nukleinsyredetektion i realtid med to isotermiske forstærkningsteknologier: rekombinerbar polymeraseforstærkning (RPA) til påvisning af positivt kontrol-DNA, der leveres i et kommercielt kit og omvendt transskriptionssløjfemedieret isotermisk forstærkning (RT-LAMP) til påvisning af klinisk meningsfulde niveauer af SARS-CoV-2 RNA.
Introduction
Isotermiske forstærkningsteknologier anvendes i vid udstrækning til påvisning af nukleinsyrer. Sammenlignet med traditionelle PCR-tilgange, der kræver termocykling, tillader isotermisk forstærkning nukleinsyreforstærkning at forekomme ved en enkelt temperatur, hvilket muliggør hurtigere time-to-results og bedre tolerance over for hæmmere1,2. En anden vigtig fordel ved isotermisk forstærkning er den reducerede instrumenteringskompleksitet. De fleste isotermiske forstærkningsreaktioner kræver kun en varmeblok og en detektionsmodalitet - enten realtidsdetektion via fluorescensovervågningeller slutpunktsdetektion, f.eks. Fluorescensdetektion i realtid opnås ved at detektere fluorescens produceret af interkalerende farvestoffer, der aktiveres i nærværelse af dobbeltstrenget DNA eller slukkede fluorescerende sonder, der aktiveres i nærværelse af specifikke dobbeltstrengede DNA-sekvenser.
Mens kommercielt tilgængelige benchtop isotermiske fluormeter findes, mange mangler tilpasning til analyse gennemførelse. For eksempel kræver mange enheder specifikke eller virksomhedsleverede forbrugsvarer, anbefaler foretrukne leverandører eller bruger proprietær software til at opnå annoncerede resultater. De fleste af disse systemer koster over $ 5.000 USD, hvilket repræsenterer en betydelig barriere for udbredt brug i ressourcebegrænsede indstillinger. Derudover står brugere i indstillinger med få ressourcer over for udfordringer med at vedligeholde udstyr, der er designet til indstillinger med høje ressourcer på grund af barske miljøforhold, svage forsyningskæder til reservedele og specialiserede værktøjer, der kræves til vedligeholdelse og reparation5. For at imødekomme dette behov, der er beskrevet her, er design og samling af et modulært og billigt fluormeter konstrueret af off-the-shelf komponenter omgivet af en kompakt 3D trykt hus (Figur 1A-C) med to valgfri konfigurationer. Den første konfiguration af denne enhed bruger kommercielt tilgængelige glasfiltre og et dichroic spejl til at blokere overskydende baggrundslys og har en samlet pris for samling af $ 830 USD. Mens disse filtre er almindeligt anvendt i fluorescens-baserede billedbehandling systemer, erstatte dyre høj kvalitet optiske filter folier har tidligere vist sig at give mulighed for nukleinsyreafsløring 6. Den anden konfiguration af fluormeteret inkorporerer disse billige filtre og erstatter dichroic spejle med φ1 / 2 "stråle splittere, hvilket reducerer de samlede omkostninger ved systemet fra $ 830 til $ 450 USD.
Repræsentative billeder af samlingen vises for den første konfiguration i figur 1 og figur 2, men analoge billeder til den anden konfiguration findes i Supplerende fil 6. For at undgå behovet for specialiseret optisk justering har det optiske system udpeget områder til at placere hver optisk komponent og kan laves med en relativt lav ende 3D-printer, hvilket giver mulighed for udbredt brug af designet. De eneste forskelle i konstruktion og samling for de to konfigurationer er de filer, der anvendes til 3D-udskrivning og de optiske komponenter placeret i kabinettet. De udvendige dimensioner af det 3D-printede kabinet til begge systemer er de samme. Tabel 1viser en omkostningssammenligning af de to systemer .
Som vist i figur 1Abestår fluormeteret af Φ1/2" (~12,5 mm) optik kombineret med kompakt belysning og detektion, der er placeret til måling af signalet gennem toppen af PCR-røret. Systemet i figur 1 er designet til at detektere farvestoffer med spidsbelastning og emissionsbølgelængder nær henholdsvis 490 nm og 525 nm, herunder FITC og nært beslægtede farvestoffer som SYBR og SYTO-9, som almindeligvis anvendes som journalister i realtid nukleinsyreforstærkningsreaktioner7,8. Excitationskilden, optiske filtre og detektor kan let erstatte komponenter, der er kompatible med forskellige fluorescerende farvestoffer som ønsket. Nukleinsyreforstærkningsreaktioner udføres typisk i PCR-rør, og fluormeteret er designet til at blive placeret oven på enhver kommercielt tilgængelig varmeblok, der holder PCR-rør (Figur 1D), hvilket giver mulighed for realtidsovervågning af isotermiske reaktioner. Passende varmeblokke er tilgængelige i de fleste biomedicinske laboratorier og kan købes for mindre end $ 500 USD.
Brugen af single-board computere til at give en billig, punkt af omhu alternativ til styring af billedbehandling teknologier er tidligere blevet påvist9. Ved at bygge ud af dette arbejde bruges der i denne protokol en computerdrevet grafisk brugergrænseflade (Figur 1D) til at lette datalogning i realtid og visning af resultater på plejepunktet, hvilket eliminerer behovet for, at en bærbar computer behandler eller visualiserer data. Fluorescensmålinger blev overført gennem I2C-protokollen fra lyssensorerne til en mikrokontroller og derefter stillet til rådighed for single-board computeren gennem seriel kommunikation. Elektriske tilslutninger til belysning og dataoverførsel blev leveret gennem forenklede ledninger og lodning på miniaturiserede breadboards, hvilket ophæver behovet for specialiserede printkort (PCB). Den software, der kræves for at køre fluormeteret, er tilgængelig via open source-softwarerammer, og den kode, der kræves for at køre enheden, findes i de supplerende kodningsfiler. Det komplette fluormeter kan samles for mellem $ 450 til $ 830 USD, og resultaterne viser, at det giver nøjagtige og pålidelige fluorescensmålinger til at overvåge isotermisk forstærkning i realtid af nukleinsyrer.
Protocol
1. Forberedelse trin: 3D print og lodning
BEMÆRK: Det optiske system, der er beskrevet i denne protokol, er designet til en standard tør blokvarmer.
- Hvis du vil oprette den første konfiguration, skal du 3D udskrive de CAD-filer, der leveres som henholdsvis Supplerende filer 1, 2 og 3:
- Hvis du vil oprette den anden konfiguration, skal du 3D udskrive de CAD-filer, der leveres som henholdsvis Supplerende filer 3, 4 og 5:
BEMÆRK: Disse dele er designet til at blive udskrevet med understøtninger. I denne vejledning anvendes en sort polycarbonatglødetråd, der kan opretholde sin form efter at være blevet udsat for temperaturer op til 110 °C. Generelt kan ethvert materiale, der kan opvarmes til temperaturen på den ønskede isotermiske reaktion uden væsentlig deformation, anvendes. For at minimere effekten af interne refleksioner og interferens i omgivende lys anbefales et materiale, der er sort eller en anden mørk farve. - Forbered de to lys-til-digital sensor evaluering moduler til parallel overvågning af to prøver. På et af sensortestbrætterne skal du fjerne R4-modstanden og lodde en jumpertråd fra højre pad i R4-området på PRINT'en til den øverste pad i R1-området på PRINT. Dette vil ændre sensorens I2C-adresse, hvilket giver mulighed for samtidig måling af begge sensorer.
BEMÆRK: Den anvendte sensor består af to PCB'er: et USB-adapterkort og et sensortestkort, der indeholder lyssensoren; Kun sensortestkortet er nødvendigt for denne enhed. - Loddetråde til hver af de to lysdioder (LED'er). Tilslut en rød ledning (positiv) til puden mærket "1" på LED'en og en sort ledning (negativ) på puden mærket "2" på LED'en. Påfør et tyndt lag termisk klæbemiddel på bagsiden af LED'en, placer LED'en på toppen af en endehætte, og vent, indtil den termiske klæbemiddel hærder. På den anden side af endehætten tilsættes en køleplade.
BEMÆRK: Når led'erne testes, før de forsegles i kabinettet, skal du sørge for at bære et ordentligt blåt lys, der blokerer øjenbeskyttelsen. - For at skabe den anden konfiguration, skæres to 1/4-tommer diameter cirkler fra en blå excitation folie ark og fire 1/4-tommer diameter cirkler fra en gul emission folie ark med saks eller et barberblad.
- Tryk på en M2.5 hexformet skær i hvert af de fire huller på den skrå del af 'LCD_Screen_Holder.stl'-delen.
2. Optisk samling
- Placer en 3/16-tommer lange 4-40 gevind indsætte i hullet på toppen af 'Optics_Enclosure_Bottom.stl' del. Placer en 1/4"-lang 4-40 gevindindsats i alle andre huller i den 3D-printede del som vist i figur 2A.
- Sæt sensortestbrættet ind i husets øverste hulrum med de fem stifter vendt mod toppen og tættest på enhedens midterakse. Fastgør med en 3/16-tommer lang 4-40 skrue gennem hullet på sensortestbrættet (Figur 2B).
- Placer en af de 20 mm brændviddelinser i afsnittet under sensortestbrættet med konveks side vendt mod bunden af enheden og væk fra prøvebrættet (Figur 2C).
- Hvis du vil oprette den første konfiguration, skal du placere det lange gennemløbsfilter i næste afsnit under den 20 mm brændviddelins (Figur 2D), der blev placeret i forrige trin. For at oprette den anden konfiguration skal du placere to gule emissionsfilterfolie i afsnittet under linsen.
- Hvis du vil oprette den første konfiguration, skal du placere dichroic spejlet i diagonalsektionen nær midten af omkapslingen, mens du observerer den filterretning, der er angivet af producenten (Figur 2E). Hvis du vil oprette den anden konfiguration, skal du placere stråledeleren i diagonalsektionen. Der kræves ingen specifik retning for stråledeleren.
- Placer en anden 20 mm brændvidde linse i afsnittet under dichroic spejl (eller stråle splitter, afhængigt af konfiguration) med konvekse side peger mod toppen af enheden (Figur 2F).
- Hvis du vil oprette den første konfiguration, skal du placere excitationsfilteret i sektionen til højre for dichroic-spejlet og sørge for, at pilen peger mod det dichroiske spejl (Figur 2G). For at oprette den anden konfiguration skal du placere en blå excitationsfilterfolie i sektionen til højre for stråledeleren.
- Sæt 15 mm brændviddelinsen til højre for excitationsfilteret med konveks side mod dichroic spejlet (Figur 2H).
- Placer en LED i den resterende del af udskriften, hvor LED'en vender mod det dichroiske spejl (eller strålesprøgelset, afhængigt af konfigurationen). Sørg for, at de to ledninger, der fører fra LED'en, indsættes i de forsænkede kanaler, så udskriften lukker tæt.
- Gentag trin 2.3-2.9 for den anden side af den 3D-printede del (Figur 2I).
- Luk den tomme side af udskriften oven på udskriften med de optiske komponenter ved at placere de ekstruderede dele af den øverste halvdel af omkapslen i de forsænkede riller i den nederste halvdel af omkapslet. Fastgør de to trykte dele sammen med 3/8-tommer lange 4-40 skruer (Figur 2J).
BEMÆRK: Hvis de to trykte dele ikke er helt lukkede, kan omstrejfende excitationslys slippe ud af det optiske hus. Sørg for, at der bæres korrekt blåt lys, der blokerer øjet, indtil der opnås en ordentlig forsegling. Reseal kabinettet, indtil ingen overskydende lys undslipper.
3. Elektronik og touchscreen samling
- Sæt de to mini breadboards sammen, og placer derefter mikrocontrolleren på et af brødpladerne. Sørg for, at mikroNB-porten på mikrocontrolleren vender udad.
- For at forbinde LED-modulation skal du tilslutte LED-driverens CTL-pin til en digital pin af mikrocontrolleren og LED-førerens (-) pin til en GND-pin af mikrocontrolleren.
- Fjern plastdækslerne på bagsiden af brødpladerne. Tryk på brødpladernes klæbende bagside på den 3D-printede del for at fastgøre de kombinerede breadboards til indersiden af den bageste del af den trykte del 'LCD_Screen_Holder.stl'.
- Fastgør LCD-skærmholderen (Liquid Crystal Display) med de samlede brødplader inde i det optiske kabinet samlet i sektion 2 med en tomme lange 4-40 skruer.
- Hvis du vil tilslutte LED-strømforsyningen, skal du tilslutte LED-driverens LED-pin (+) til den første LED-lysdiodes positive ledning. Tilslut den første LED's negative ledning til den positive ledning af den anden LED på brødpladen. Tilslut den anden LED-lednings negative ledning til LED-førerens LED-stift (-).
BEMÆRK: Rækkefølgen af første eller anden LED er vilkårlig. - For at tilslutte LED-driverens strømforsyning skal du tilslutte de positive og negative ledninger i 10 V-strømforsyningen til henholdsvis VIN+ og VIN-stifterne på LED-driveren. (En tønde stik til to-bens adapter blev brugt.)
- Tilslut sensortestkortets strømforsyning og dataoverførsel. Der bruges kun fire stifter på sensortestkortet: SCK, SDA, VDUT og GND. Tag en 4-benet kvinde til mandlig jumpertråd, og tilslut disse stifter på de lys-til-digitale sensortestbrætter til mini breadboardet gennem hullet øverst til højre på LCD-holderprintet.
- På brødpladen skal der sikres forbindelser mellem følgende: mikrocontrollerens 3,3 V-ben og dataskærmstiften på begge testtavler; gndstiften af mikrocontrolleren og GND-stiften på begge testtavler mikrokontrollerens analoge 4 (A4) pin og SDA-stiften på begge testtavler og den analoge 5 (A5) pin af mikrocontrolleren og SCK pin af begge test boards.
BEMÆRK: Da I2C-kommunikation bruges til lyssensorerne, kan SCK- og SDA-stifterne på begge sensorer begge føres til de samme stifter af mikrocontrolleren. - Fastgør den enstrengede computer på LCD-skærmholderen med fire M2.5-skruer. Sørg for, at HDMI- og strømforsyningsportene på den enstrengede computer vender opad, og at single-board-computeren er centreret på den 3D-printede del.
- touchscreen-skærmen til den enbordscomputer i henhold til instruktionerne på berøringsskærmen, og tilslut derefter HDMI-porten på den enbordscomputer til berøringsskærmens HDMI-port.
4. Softwareinstallation
- Installer og brug webeditoren til at uploade den brugerdefinerede skitse "MiniFluorimeter_2Diode.ino" i Supplerende kodningsfil 1 til mikrocontrolleren. Kontroller, at biblioteket "ClosedCube OPT3002" er installeret ved hjælp af Biblioteksstyring.
- Ret variabel led_A_pin til nummeret på den digitale pin, der blev brugt i trin 3.3 (sektionen Elektronik og samling på berøringsskærm).
- Juster antallet af millisekunder, som LED'en er tændt, når der anskaffes fluorescensmålinger, ved at ændre værdien af variablen ExposureTime. Juster antallet af millisekunder mellem LED-eksponeringer ved at ændre værdien af variablen led_A_Interval.
- Ret variablen led_Power til et tal mellem nul og en for at justere lysstyrken på LED'erne under eksponeringer. Nul giver den maksimale mængde lysstyrke, og den ene giver den laveste lysstyrke.
- Tænd for muligheden for at styre skærmen via berøringsskærmen ved at følge producentens anvisninger, der følger med 3,5" skærmen.
BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan 3,5" skærmen bruges som skærm uden berøringsskærmfunktioner, og der kan knyttes et tastatur og en mus til USB-portene på den enstrengede computer til styring af single-board-computeren. - Hent filen "MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" fra Supplerende kodningsfil 2 til en ønsket placering på single-board-computeren.
- Sørg for, at en fungerende version af Python er installeret på single-board-computeren . Python 3.7 blev brugt i det medfølgende Python-modul, men enhver stabil Python-version kunne bruges med passende ændringer af det medfølgende script. Installer de biblioteker, der er nødvendige for Python-programmet, på single-board-computeren.
- Ret variablen measurement_time til den tid, det tager at foretage målinger. Programmet afslutter anskaffelsen og lukker, når den ønskede tid er gået. Gui'en gør det også muligt at afslutte anskaffelsen via en knap på brugergrænsefladen.
- Ret variablen serialPort til den tilsluttede mikrocontrollers serielle adresse.
5. Registrering af fluorescensdata i realtid
- Tænd den kommercielle varmeblok og lad den nå den ønskede temperatur.
- Tænd den enstrengede computer med en standard 5 V strømforsyning, der leveres med de fleste enkeltkorts computerkøb. Tilslut single-board computeren til mikrocontrolleren med et microUSB til USB-kabel.
- Åbn det medfølgende Python-script ved hjælp af berøringsskærmen. Ret variablerne measurement_time og serialPort til de ønskede værdier. Ret variablen outputFilepath til navnet på den datafil, programmet genererer. Kontroller, at filnavnet slutter i '.xlsx'.
- Placer to PCR-rør, der indeholder de reaktioner, der skal overvåges, i varmeblokken. Sørg for, at placeringen af PCR-rørene flugter med fluormeterets optiske kanaler, når det er placeret på varmeblokken.
- Placer fluormeteret oven på varmeblokken med PCR-rørene centreret mellem de fire pløkker, der ekstruderer fra hver optisk kanal på fluormeteret. For optimale målinger skal du sikre dig, at det 3D-printede fluormeter er fastgjort sikkert i varmeblokkens brønde.
- Tilslut fluormeteret sikkert, tilslut strømforsyningsadapteren til LED'erne.
- Brug berøringsskærmen til at starte Python-programmet. Der vises en grafisk brugergrænseflade på LCD-skærmen, og realtidslysset vises.
- Overhold realtidsfluorescensmålingerne over tid for begge PCR-rør, der vises til brugeren på gui'en.
- Efter at den forsøgstid, som brugeren har bestemt, er udløbet, ophører erhvervelsen. Få vist målingerne i outputdatafilen, der er gemt på den brugerdefinerede placering. Hvis du vil afslutte målingerne tidligt, skal du klikke på knappen "Stop anskaffelse" på brugergrænsefladen.
Representative Results
Når fluormeteret er samlet, kan det valideres ved at måle fluorescens fra en fortyndingsserie af FITC-farvestof. I figur 3Avises målinger af FITC-farvestof i koncentrationer på 0, 20, 40, 60 og 80 pg/μL fremstillet i 1x PBS på begge kanaler i den første konfiguration af fluormeteret. Hver prøve blev målt tre gange med en LED-eksponering på 1,5 s med 20 intervaller. Begge kanaler på fluormeteret viser en lineær respons på tværs af det ønskede område.
Fluormeterets kliniske anvendelighed blev yderligere påvist ved at bruge systemet sammen med en kommercielt tilgængelig tør varmeblok til at udføre forstærkning med to isotermiske forstærkningsteknologier: RPA og RT-LAMP.
Figur 3B viser det baseline-subtraktive tidsforløb med fluorescens målt ved 39 °C forstærkning af 50 μL RPA-positive og negative kontrolreaktioner i realtid for kit-positive kontrol-DNA, der findes i et standard kommercielt kit og udarbejdes pr. producents anvisninger. RPA-reaktioner, som giver et relativt lavt fluorescensniveau, blev målt ved hjælp af den første konfiguration af fluormeteret, der opnår bedre undertrykkelse af excitationslys.
Figur 3C viser tidsbanemålingen af en brugerdefineret RT-LAMP-analyse ved 65 °C ved hjælp af N2-, E1- og As1e-primersættene beskrevet af Zhang etal. 10og Rabe og Cepko11. RT-LAMP-reaktioner giver en større mængde fluorescens og blev målt ved hjælp af den anden, billigere fluormeterkonfiguration. Oligonukleotider blev købt og genbrugt i 2x TE buffer ved en 1 mM koncentration. Fremad indre primer (FIP) og bagud indre primer (BIP) oligoer blev bestilt med højtydende flydende kromatografi rensning. Hvert primersæt (N2, E1 og As1e) blev kombineret til at fremstille 1000 μL af en 25x blanding som følger: 40 μL FIP, 40 μL BIP, 5 μL F3, 5 μL B3, 10 μL LF, 10 μL LB og 890 μL 1x TE-buffer. For at samle hver RT-LAMP-reaktion blev der tilsat 1 μL af hvert primersæt til 0,5 μL 50x fluorescerende farvestof og 12,5 μL 2x masterblanding, og reaktionsvolumenet blev bragt op til 20 μL med kernefrit vand pr. producents anvisninger. SARS-CoV-2 RNA-styringen blev serielt fortyndet i nukleasefrit vand til koncentrationer på 10, 100 eller 1.000 kopier pr. μL, og der blev tilsat 5 μL for et samlet reaktionsvolumen på 25 μL. Den ingen målkontrol (NTC), der blev anvendt i alle eksperimenter, var nukleasefrit vand. RT-LAMP-reaktioner blev overlejret med 25 μL mineralolie af molekylærbiologisk kvalitet.
RPA- og RT-LAMP-reaktioner blev samlet i to brønde af en 0,2 mL lavprofil 8-rørs PCR-strimmel og udjævnet med ultraklare flade hætter. Hver RPA og RT-LAMP reaktion blev kørt i tre eksemplarer. I alle test kvantificerede minifluormeteret med succes den tidsmæssige stigning i fluorescensniveauer forbundet med DNA-forstærkning.
Figur 1: Optisk hus og samlet miniaturefluormeter oven på varmeblokken. (B) Diagram over den første konfiguration af miniaturefluormeteret efter montering. (C) Fotografi af det optiske hus med optiske komponenter placeret i en detektionskanal. (D) Fotografi af samlet miniaturefluormeter placeret oven på en kommercielt tilgængelig varmeblok. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Samlings- og elektrisk kontroldiagram over miniaturefluormeteret. A-J) Trinvis placering af de optiske komponenter i det 3D-printede optiske kabinet til den første systemkonfiguration. (K) Elektrisk diagram over miniaturefluormeteret for begge konfigurationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative målinger opnået med miniaturefluormeteret ( A) Målt fluorescens vs. FITC-farvestofkoncentration i begge kanaler viser lineær respons på tværs af det ønskede dynamiske område. (B) Real-time fluorescens vs tid til isotermisk forstærkning af positive og negative kontroller af en kommercielt tilgængelig kit. Forstærkning sker som forventet for den positive kontrol. (C) Fluorescens i realtid vs. tid til isotermisk forstærkning på 50,500 og 5000 kopier af SARS-CoV-2 RNA og en NTC-prøve fra en brugerdefineret RT-LAMP-analyse. Forstærkning sker som forventet nær grænsen for påvisning af analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.
| System 1 | System 2 | |||
| vare | kvantitet | Samlet pris (USD) | kvantitet | Samlet pris (USD) |
| Optiske komponenter | ||||
| linser | 6 | 158.14 | 6 | 158.14 |
| Spejle | 2 | 244.56 | 2 | 60 |
| Optiske filtre | 4 | 200 | 6 | 5 |
| subtotal | 602.7 | subtotal | 223.14 | |
| Belysning og detektion | ||||
| Lysdioder | 2 | 72.62 | 2 | 72.62 |
| LED-driver | 1 | 11.49 | 1 | 11.49 |
| Fotodiode | 2 | 50 | 2 | 50 |
| subtotal | 134.11 | subtotal | 134.11 | |
| Elektronik og skærm | ||||
| Arduino Nano | 1 | 20.7 | 1 | 20.7 |
| Hindbær Pi | 1 | 35 | 1 | 35 |
| LCD-skærm | 1 | 25 | 1 | 25 |
| Mini Breadboard | 1 | 4 | 1 | 4 |
| 10 V strømforsyning | 1 | 8.6 | 1 | 8.6 |
| subtotal | 93.3 | subtotal | 93.3 | |
| Kostbeløb (USD) | 830.11 | 450.55 | ||
Tabel 1: Omkostningssammenligning af miniaturefluormeterets to konfigurationer.
Supplerende fil 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl, og klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: LCD_Screen_Holder.stl Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl, og klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: System2_BuildInstructions.pdf Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino Klik her for at downloade denne kodningsfil.
Supplerende kodningsfil 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py Klik her for at downloade denne kodningsfil.
Discussion
Beskrevet her er en open source, billige, modulære, bærbare fluorometer for kvantitative fluorescens påvisning af isotermisk forstærkning reaktioner. Open source-projekter letter hurtig og billig vedligeholdelse med let tilgængelige reservedele og giver brugerne fleksibilitet til at tilpasse systemet til deres behov baseret på modulært design. Denne protokol beskriver processen med at samle mekaniske, optiske og elektriske komponenter og validere optisk ydeevne. Desuden blev fluormeterets fleksibilitet til at overvåge to forskellige typer isotermiske forstærkningsanalyser med væsentligt forskellige krav til temperatur, volumen og fluorescens, RPA exo og RT-LAMP, påvist. RPA udføres ved 39 °C i 50 μL-reaktioner, der anvender en sekvensspecifik FAM-mærket sonde til fluorescensgenerering, mens RT-LAMP udføres ved 65 °C i et 25 μL reaktionsvolumen og bruger et interkalerende farvestof til at rapportere tilstedeværelsen af det forstærkede DNA. Da fluorescensmålinger foretages gennem toppen af PCR-rør med flade hætter, er fluormeteret i stand til at detektere fluorescens fra både analysemængder, og varmebehovet er kun begrænset af den valgte kommercielle varmeblok. Desuden er lysstofintensiteten i RT-LAMP næsten i størrelsesordenen større end den, der produceres i RPA, på grund af de farvestof- versus sondebaserede metoder til fluorescenssignalgenerering. Det valgte dynamiske område for den valgte optiske sensor kan imidlertid registrere og kvantificere både signalerne, og baseline subtraktionsalgoritmer tegner sig for disse forskelle for at producere pålidelige fluorescensaflæsninger.
For at lette teknologiformidling og minimere potentielle vedligeholdelsesomkostninger blev der anvendt et modulært design, der er kompatibelt med varmeapparater, der er bredt tilgængelige i forskellige indstillinger. I den nuværende protokol blev der anvendt en fælles tør blokvarmer; samme optiske og elektriske design kan let tilpasses andre kommercielt tilgængelige varmeapparater. Hvis der skal anvendes en anden tør blokvarmer, kræves der minimale ændringer i 3D-husets design. Nærmere bestemt skal de nederste pløkker i det optiske kabinets STL-filer ændres for at sikre korrekt tilpasning til brøndene i andre kommercielle varmeblokke. Mens de kabinetter, der er vist i eksemplerne, blev trykt på en relativt lav ende 3D-printer (se Materialetabel), skal man sørge for, at printeropløsningen og/eller printtolerancerne er tilstrækkelige til at rumme de optiske komponenter og gevindindsatser. I de angivne STL-filer blev der tilføjet en tolerance på 0,01-0,02 tommer på hver side af de optiske komponenter i radiale og aksiale retninger baseret på de dimensioner, der er angivet af producenten. Dette sikrer, at alle optiske komponenter passer sikkert ind i udskriften, og at kabinettet helt blokerer overskydende lys fra at komme ind eller undslippe. For at sikre, at der er korrekt tryktilpasning til de gevindindsatser, blev der fratreret en lignende tolerance på 0,01-0,02 tommer fra den diameter, der leveres af producenten, i CAD-filen.
RPA-reaktionerne blev overvåget med succes ved hjælp af den første fluormeterkonfiguration, mens RT-LAMP-reaktioner kunne overvåges ved hjælp af begge konfigurationer. Den forbedrede omstrejfende lys afvisning af den første konfiguration var nødvendig for at overvåge de lave niveauer af fluorescens produceret af fluorogen sonde i RPA reaktioner. I modsætning hertil bruger RT-LAMP et intercalating farvestof til signalgenerering, hvilket resulterer i en højere fluorescensintensitet, der er kompatibel med det lavere dynamiske område i den anden konfiguration ved hjælp af fotografiske filterfolie. Brugerne bør vælge det fluormeter konfiguration, der matcher fluorescens signal genererer element-intercalating farvestof eller fluorogen sonde-af deres analyse.
En begrænsning af dette system er, at opvarmning leveres af en kommercielt tilgængelig varmeblok drevet gennem en standard stikkontakt. Dette system kan videreudvikles til brug i områder , hvor der ikke er pålidelig adgang til elektricitet , ved at inkorporere bærbare og genopladelige batteripakker som vist af andre grupper12. En anden begrænsning er systemets relativt lave gennemløb, som giver mulighed for samtidig fluorescensmåling af kun to prøver ad gangen. Flere udskrifter af kabinettet kan placeres oven på den samme varmeblok for at øge gennemstrømningen; Den anvendte lyssensor har dog kun fire unikke I2C-adresser. Dette begrænser det maksimale antal prøver, der samtidig kan måles til fire. En anden lyssensor med et større antal unikke I2C-adresser er nødvendig for yderligere at øge gennemløb.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Særlig tak til Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul og Christopher Goh for deres hjælp med prøveforberedelse. Forfatterne takker Caroline Noxon for manuskript revision. Finansiering af dette arbejde blev ydet fra det amerikanske folk af USAID gennem en IAVI forskning tilskud CCID 9204 under tildeling AID-OAA-A16-00032 mellem IAVI og USAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED - 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
References
- Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
- Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).
