Summary
הוראות מפורטות ניתנות לבניית פלואורימטר מודולרי בקוד פתוח התואם לתנורי חימום רבים בעלות נמוכה לביצוע הגברה של חומצת גרעין איסותרמית כמותית בזמן אמת.
Abstract
שיטות מסורתיות לגילוי וכימות חומצות גרעין מסתמכות על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ודורשות שימוש בתרמוציקלרים יקרים עם זיהוי פלואורסצנטי משולב של אמפליקונים. טכנולוגיות הגברה של חומצות גרעין איסותרמיות מבטלות את הצורך ברכיבה תרמית; עם זאת, זיהוי מבוסס פלואורסצנטיות של מוצרים עדיין נדרש לתוצאות כמותיות בזמן אמת. מספר תנורי חימום איסותרמיים ניידים עם זיהוי פלואורסצנטי משולב זמינים כעת מסחרית; עם זאת, העלות של התקנים אלה נותרה חסם משמעותי לאימוץ נרחב בהגדרות מוגבלות משאבים. להלן פרוטוקול לתכנון והרכבה של פלואורימטר מודולרי בעלות נמוכה הבנוי מרכיבים מחוץ למדף. מוקף דיור מודפס 3D קומפקטי, הפלואורימטר נועד להיות ממוקם על גבי בלוק חום זמין מסחרית מחזיק צינור PCR. הפלואורימטר המתואר כאן היה אופטימיזציה כדי לזהות פלואורסצנטין isothiocyanate (FITC) צבע, אבל המערכת יכולה להיות שונה לשימוש עם צבעים נפוץ ככתבים בתגובות הגברה חומצת גרעין בזמן אמת. הישימות הקלינית של המערכת מודגמת על ידי ביצוע זיהוי חומצות גרעין בזמן אמת עם שתי טכנולוגיות הגברה איסותרמיות: הגברה פולימראז recombinase (RPA) לגילוי DNA שליטה חיובית המסופקת בערכה מסחרית והגברת isothermal בתיווך לולאה הפוכה (RT-LAMP) לגילוי רמות משמעותיות קלינית של SARS-CoV-2 RNA.
Introduction
טכנולוגיות הגברה Isothermal נמצאים בשימוש נרחב לגילוי של חומצות גרעין. בהשוואה לגישות PCR מסורתיות הדורשות תרמוציקלינג, הגברה איזותרמית מאפשרת הגברה של חומצת גרעין להתרחש בטמפרטורה אחת, ובכך מאפשרת זמן לתוצאות מהיר יותר וסובלנות טובה יותר של מעכבים1,2. יתרון מרכזי נוסף של הגברה איסותרמית הוא מורכבות המכשור המופחתת. רוב תגובות הגברה isothermal רק דורשים בלוק חום וזיהוי מודאליות - או זיהוי בזמן אמת באמצעות ניטור פלואורסצנטיות או זיהוי נקודת קצה, למשל על ידי זרימה לרוחב או אלקטרופורזה ג'ל3,4. זיהוי פלואורסצנטיות בזמן אמת מושגת באמצעות זיהוי פלואורסצנטיות המיוצרת על ידי צבעים משולבים המופעלים בנוכחות דנ"א דו-גדילי או בדיקות פלואורסצנטיות מרווה המופעלות בנוכחות רצפי דנ"א דו-גדיליים ספציפיים.
בעוד פלואורימטרים איזותרמיים זמינים מסחרית על הספסל קיימים, רבים חסרים התאמה אישית ליישום מבחנים. לדוגמה, מכשירים רבים דורשים חומרים מתכלים ספציפיים או שסופקו על-ידי החברה, ממליצים על ספקים מועדפים או משתמשים בתוכנות קנייניות כדי להשיג תוצאות שפורסמו. רוב המערכות הללו עולות יותר מ-5,000 דולר, מה שמייצג מחסום משמעותי לשימוש נרחב במסגרות המוגבלות במשאבים. בנוסף, משתמשים בהגדרות בעלות משאבים נמוכים מתמודדים עם אתגרים לתחזוקת ציוד המיועד להגדרות בעלות משאבים גבוהים בשל תנאי סביבה קשים, שרשראות אספקה חלשות לחלקי חילוף וכלים מיוחדים הדרושים לתחזוקה ותיקון5. כדי לענות על צורך זה, המתואר כאן הוא העיצוב וההרכבה של פלואורימטר מודולרי בעלות נמוכה שנבנה מרכיבים מן המדף מוקף דיור מודפס 3D קומפקטי (איורים 1A-C) עם שתי תצורות אופציונליות. התצורה הראשונה של מכשיר זה משתמשת במסנני זכוכית זמינים מסחרית ומראה dichroic כדי לחסום אור רקע עודף ויש לו עלות כוללת של הרכבה של $830 USD. בעוד מסננים אלה משמשים בדרך כלל במערכות הדמיה מבוססות פלואורסצנטיות, החלפת רדידים אופטיים יקרים בדרגה גבוהה הוכח בעבר לאפשר זיהוי חומצת גרעין6. התצורה השנייה של הפלואורימטר משלבת מסננים זולים אלה ומחליפה את המראות הדיכריות במפצלי קרן φ1/2 אינץ', מה שמפחית את העלות הכוללת של המערכת מ$830 דולר ל$450 דולר.
תמונות מייצגות של ההרכבה מוצגות לתצורה הראשונה באיור 1 ובאיור 2, אך תמונות מקבילות לתצורה השנייה ניתן למצוא בקובץ משלים 6. כדי למנוע את הצורך ביישור אופטי מיוחד, למערכת האופטית יש אזורים ייעודיים למקם כל רכיב אופטי וניתן לבצע אותה באמצעות מדפסת תלת-ממד נמוכה יחסית, המאפשרת שימוש נרחב בתכנון. ההבדלים היחידים בבנייה ובהרכבה עבור שתי התצורות הם הקבצים המשמשים להדפסה בתלת-ממד והרכיבים האופטיים הממוקמים במארז. הממדים החיצוניים של המארז המודפס בתלת-ממד עבור שתי המערכות זהים. השוואת עלויות בין שתי המערכות מוצגת בטבלה 1.
כפי שמוצג באיור 1A, כדי לשמור על גורם צורה קטן, הפלואורימטר מורכב מאופטיקה של Φ1/2 אינץ' (כ-12.5 מ"מ), יחד עם תאורה קומפקטית וזיהוי הממוקמים למדידת אות דרך החלק העליון של צינור PCR. המערכת באיור 1 נועדה לזהות צבעים עם אורכי גל של עירור ופליטה קרובים ל-490 ננומטר ו-525 ננומטר, בהתאמה, כולל FITC וצבעים קרובים כמו SYBR ו-SYTO-9, המשמשים בדרך כלל ככתבים בתגובות הגברה של חומצות גרעין בזמן אמת7,8. ניתן להחליף בקלות את מקור העירור, המסננים האופטיים והגלאי ברכיבים התואמים לצבעים פלואורסצנטיים שונים לפי הצורך. תגובות הגברה של חומצות גרעין מבוצעות בדרך כלל בצינורות PCR, והפלואוריאמטר מתוכנן להיות ממוקם מעל כל בלוק חום מסחרי זמין המחזיק צינורות PCR (איור 1D) המאפשר ניטור בזמן אמת של תגובות איזותרמיות. בלוקי חום מתאימים זמינים ברוב המעבדות הביו-רפואיות וניתן לרכוש אותם בפחות מ- $500 USD.
השימוש במחשבים חד-לוחיים כדי לספק חלופה זולה של טיפול בשליטה בטכנולוגיות הדמיה הוכח בעבר9. בהסתמך על עבודה זו, בפרוטוקול זה נעשה שימוש בממשק משתמש גרפי המופעל באמצעות מחשב יחיד (איור 1D) כדי להקל על רישום נתונים בזמן אמת והצגת תוצאות בנקודת הטיפול, ובכך מבטל את הצורך במחשב נייד לעבד או לדמיין נתונים. מדידות פלואורסצנטיות הועברו דרך פרוטוקול I2C מחיישני האור למיקרו-בקר, ולאחר מכן הפכו לזמינות למחשב בעל לוח יחיד באמצעות תקשורת טורית. חיבורים חשמליים לתאורה והעברת נתונים סופקו באמצעות חיווט פשוט והלחמה על לוחות לחם ממוזערים, ובכך שללו את הצורך בלוחות מעגלים מודפסים (PCB) מיוחדים. התוכנה הנדרשת להפעלת הפלואורימטר זמינה באמצעות מסגרות תוכנה בקוד פתוח והקוד הדרוש להפעלת ההתקן מסופק בקבצי הקידוד המשלימים. פלואורימטר מלא ניתן להרכיב בין $450 כדי $830 USD, והתוצאות מראות כי הוא מספק מדידות פלואורסצנטיות מדויקות ואמינות כדי לפקח על הגברה isothermal בזמן אמת של חומצות גרעין.
Protocol
1. שלבי הכנה: הדפסה תלת מימדית והלחמה
הערה: המערכת האופטית המתוארת בפרוטוקול זה מיועדת לתנור בלוק יבש סטנדרטי.
- כדי ליצור את התצורה הראשונה, הדפס בתלת-ממד את קבצי ה- CAD המסופקים כקבצים משלימים 1, 2 ו- 3 בהתאמה:
- כדי ליצור את התצורה השניה, 3D להדפיס את קבצי CAD המסופקים כקבצים משלימים 3, 4, ו 5, בהתאמה:
הערה: חלקים אלה מיועדים להדפסה עם תמיכות. במדריך זה, חוט פוליקרבונט שחור משמש שיכול לשמור על צורתו לאחר שנחשף לטמפרטורות של עד 110 מעלות צלזיוס. באופן כללי, ניתן להשתמש בכל חומר שניתן לחמם לטמפרטורה של התגובה האיזותרמית הרצויה ללא עיוות משמעותי. כדי למזער את ההשפעה של השתקפויות פנימיות והפרעות תאורת הסביבה, מומלץ חומר שחור או צבע כהה אחר. - הכינו את שני מודולי הערכת החיישנים הקלים לדיגיטליים לניטור מקביל של שתי דגימות. באחד מלוחות הבדיקה של החיישן, הסר את נגד R4 והלחים חוט מגשר מהמשטח הימני של אזור R4 ב- PCB למשטח העליון באזור R1 ב- PCB. זה ישנה את כתובת I2C של החיישן, ובכך יאפשר מדידה בו זמנית של שני החיישנים.
הערה: החיישן המשמש מורכב משני PCB: לוח מתאם USB ולוח בדיקה חיישן המכיל את חיישן האור; רק לוח הבדיקה של החיישן נחוץ עבור התקן זה. - חוטי הלחמה לכל אחד משני דיודות פולטות האור (נוריות). חבר חוט אדום (חיובי) למשטח שכותרתו "1" על נורית ה-LED וחוט שחור (שלילי) על הפנקס שכותרתו "2" על הנורית. החל שכבה דקה של דבק תרמי על הגב של LED, למקם את LED על החלק העליון של כובע קצה, ולחכות עד תרופות דבק תרמי. בצד השני של מכסה הקצה, מוסיפים מפזר חום.
הערה: בעת בדיקת נוריות לפני שהם אטומים במארז, הקפד ללבוש אור כחול תקין חוסם הגנה על העיניים. - כדי ליצור את התצורה השנייה, חתוך שני עיגולים בקוטר 1/4 אינץ' מגיליון רדיד עירור כחול וארבעה עיגולים בקוטר 1/4 אינץ' מגיליון רדיד פליטה צהוב עם מספריים או סכין גילוח.
- לחץ על תוסף בצורת הקסטל M2.5 לתוך כל אחד מארבעת החורים בחלק המשופע של החלק 'LCD_Screen_Holder.stl'.
2. הרכבה אופטית
- הנח תוסף 3/16 אינץ' ארוך 4-40 משורשר לתוך החור בחלק העליון של החלק 'Optics_Enclosure_Bottom.stl'. הנח תוסף משורשר באורך 4.40 אינץ' לכל החורים האחרים בחלק המודפס בתלת-ממד, כפי שמוצג באיור 2A.
- הכנס את לוח הבדיקה של החיישן לחלל העליון של הדיור, כאשר חמשת הפינים פונים לכיוון החלק העליון והקרב ביותר לציר המרכזי של ההתקן. מאובטח עם בורג באורך 4.40 אינץ' באורך 3/16 אינץ' דרך החור בלוח הבדיקה של החיישן (איור 2B).
- הניחו את אחת מעדשות אורך המוקד של 20 מ"מ בחלק שמתחת ללוח הבדיקה של החיישן כשצד הקמור פונה לכיוון תחתית ההתקן ומרוחק מלוח הבדיקה (איור 2C).
- ליצירת התצורה הראשונה, מקמו את מסנן המעבר הארוך במקטע הבא מתחת לעדשת אורך המוקד של 20 מ"מ (איור 2D)הממוקמת בשלב הקודם. כדי ליצור את התצורה השנייה, מקם שני רדידים של מסנן פליטה צהוב במקטע שמתחת לעדשה.
- כדי ליצור את התצורה הראשונה, מקם את השיקוף הדיכרוי במקטע האלכסוני ליד מרכז מעטפת המערכת תוך התבוננות בכיוון המסנן שצוין על-ידי היצרן (איור 2E). כדי ליצור את התצורה השניה, מקם את מפצל הקרן במקטע האלכסוני. אין צורך בכיוון ספציפי עבור מפצל הקרן.
- הנח עדשת אורך מוקד שנייה בגודל 20 מ"מ בחלק שמתחת למראה הדה-כרואית (או מפצל הקרן, בהתאם לתצורה) כאשר הצד הקמור מצביע לכיוון החלק העליון של ההתקן (איור 2F).
- כדי ליצור את התצורה הראשונה, מקם את מסנן העירור במקטע שמימין למראה הדיכרית, וודא שהחץ מצביע לכיוון המראה הדיכרית (איור 2G). כדי ליצור את התצורה השניה, מקם רדיד מסנן עירור כחול אחד לתוך המקטע שמימין למפצל הקרן.
- הנח את עדשת אורך המוקד של 15 מ"מ מימין למסנן העירור כשצד הקמור פונה למראה הדה-כרוית(איור 2H).
- הנח נורית לתוך החלק הנותר של ההדפסה, כאשר נורית ה- LED פונה לכיוון המראה הדיכרית (או מפצל הקרן, בהתאם לתצורה). ודא ששני החוטים המובילים מהנורית מוכנסים לתוך הערוצים שקועים כך שההדפסה תיסגר בחוזקה.
- חזור על שלבים 2.3-2.9 בצד השני של החלק המודפס בתלת-ממד (איור 2I).
- סגור את הצד הריק של ההדפסה מעל ההדפסה עם הרכיבים האופטיים על-ידי הצבת החלקים המובלטים של החצי העליון של האנקה בחריצים הש שקועים של החצי התחתון של הטביעה. אבטחו את שני החלקים המודפסים יחד עם ברגים באורך 4.40 אינץ' באורך 3/8 אינץ' (איור 2J).
הערה: אם שני החלקים המודפסים אינם סגורים לחלוטין, אור עירור תועה יכול לברוח מהדיור האופטי. ודאו שהאור הכחול הנכון חוסם את ההגנה על העיניים עד להשגת חותם מתאים. יש לאחסום מחדש את המתחם עד שלא יימלט אור עודף.
3. הרכבת אלקטרוניקה ומסך מגע
- חבר את שני לוחות הלחם הקטנים יחד, ולאחר מכן הנח את המיקרו-בקר על אחד מלוחות הלחם. ודאו שיציאת המיקרו-אוסB של המיקרו-בקר פונה כלפי חוץ.
- כדי לחבר אפנון LED, חבר את פין ה- CTL של מנהל ההתקן LED (+) לסיכה דיגיטלית של המיקרו-בקר ואת פין ה- LED (-) של מנהל ההתקן LED לסיכת GND של המיקרו-בקר.
- מוציאים את כיסויי הפלסטיק בחלק האחורי של לוחות הלחם. לחץ על גב הדבק של לוחות הלחם לחלק המודפס בתלת-ממד כדי לחבר את לוחות הלחם המשולבים לחלק הפנימי של החלק האחורי של החלק המודפס 'LCD_Screen_Holder.stl'.
- אבטחו את מחזיק המסך של תצוגת הגביש הנוזלי (LCD) עם לוחות הלחם שהורכבו בפנים למארז האופטי המורכב בסעיף 2 עם ברגים באורך 4-40 אינץ'.
- כדי לחבר את ספק הכוח LED, לחבר את פין LED (+) של מנהל ההתקן LED לחוט החיובי של הנורית הראשונה. חבר את החוט השלילי של נורית LED הראשונה לחוט החיובי של נורית LED השנייה על לוח הלחם. חבר את החוט השלילי של נורית ה- LED השניה לפין ה- LED (-) של מנהל ההתקן LED.
הערה: סדר נורית LED ראשונה או שנייה הוא שרירותי. - כדי לחבר את ספק הכוח של מנהל ההתקן LED, חבר את החוטים החיוביים והשליליים של ספק הכוח 10 V לסיכות VIN+ ו- VIN של מנהל ההתקן LED, בהתאמה. (נעשה שימוש בשקע חבית למתאם בן שני פינים).)
- חבר את ספק הכוח והעברת הנתונים של לוח הבדיקה של החיישן. רק ארבעה פינים בלוח הבדיקה של החיישן משמשים: SCK, SDA, VDUT ו- GND. קח נקבה 4 פינים חוט מגשר זכר ולחבר סיכות אלה על לוחות בדיקת חיישן אור לדיגיטל ללוח לחם מיני דרך הפער בפינה השמאלית העליונה של הדפס מחזיק LCD.
- על לוח הלחם, להבטיח חיבורים בין הבאים נמצאים במקום: סיכת 3.3 V של מיקרו-בקר ואת סיכת VDUT של שני לוחות הבדיקה; סיכת GND של המיקרו-בקר וסיכת ה- GND של שני לוחות הבדיקה; הסיכה האנלוגית 4 (A4) של המיקרו-בקר וסיכת ה- SDA של שני לוחות הבדיקה; ואת הסיכה אנלוגי 5 (A5) של מיקרו-בקר ואת סיכת SCK של שני לוחות הבדיקה.
הערה: מכיוון שתקשורת I2C משמשת לחיישני האור, ניתן לנתב את סיכות ה- SCK וה- SDA של שני החיישנים לאותם סיכות של המיקרו-בקר. - אבטח את המחשב בעל הלוח היחיד במחזיק מסך ה-LCD עם ארבעה ברגים M2.5. ודא שיציאות ה-HDMI ומתאם המתח של המחשב בעל הלוח היחיד פונות כלפי מעלה והמחשב בעל הלוח היחיד ממורכז בחלק המודפס בתלת-ממד.
- חבר את צג מסך המגע למחשב בעל לוח יחיד בהתאם להוראות מסך המגע ולאחר מכן חבר את יציאת ה- HDMI של המחשב בעל הלוח היחיד ליציאת ה- HDMI של מסך המגע.
4. התקנת תוכנה
- התקן והשתמש בעורך האינטרנט כדי להעלות את הסקיצה המותאמת אישית "MiniFluorimeter_2Diode.ino" המסופקת בקובץ קידוד משלים 1 אל המיקרו-בקר. ודא שהספריה "ClosedCube OPT3002" מותקנת באמצעות מנהל הספריות.
- שנה את המשתנה led_A_pin למספר הסיכה הדיגיטלית המשמשת בשלב 3.3 (מקטע הרכבה של אלקטרוניקה ומסך מגע).
- התאם את מספר אלפיות השניה שהנורית מופעלת בעת רכישת מדידות פלואורסצנטיות על-ידי שינוי הערך של המשתנה ExposureTime. התאם את מספר אלפיות השניה בין חשיפות LED על-ידי שינוי הערך של המשתנה led_A_Interval.
- שנה את המשתנה led_Power למספר בין אפס לאחד כדי להתאים את בהירות נוריות ה- LED במהלך החשיפות. אפס מעניק את הכמות המרבית של בהירות ואחד נותן את הכמות הנמוכה ביותר של בהירות.
- הפעל את היכולת לשלוט בצג באמצעות מסך מגע על-ידי ביצוע הוראות היצרן המצורפות לצג בגודל 3.5 אינץ'.
הערה: אם תרצה, ניתן להשתמש במסך בגודל 3.5 אינץ' כצג ללא יכולות מסך מגע, וניתן לחבר מקלדת ועכבר ליציאות ה- USB של המחשב בעל הלוח הבודד לשליטה במחשב בעל לוח יחיד. - הורד את הקובץ "MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" מקובץ קידוד משלים 2 למיקום הרצוי במחשב לוח יחיד.
- ודא שגירסת עבודה של Python מותקנת במחשב בעל לוח יחיד . פייתון 3.7 שימש במודול פייתון שסופק, אך ניתן להשתמש בכל גרסת פייתון יציבה עם שינויים מתאימים בתסריט שסופק. התקן את הספריות הדרושות לתוכנית פייתון במחשב בעל לוח יחיד.
- שנה את המשתנה measurement_time למשך הזמן הרצוי למדידות. התוכנית מסיימת את הרכישה ונסגרת לאחר שחלף הזמן הרצוי. ממשק המשתמש הגרפי (GUI) מאפשר גם לסיים את הרכישה באמצעות לחצן בממשק המשתמש.
- שנה את ה- serialPort המשתנה לכתובת הטורית של המיקרו-בקר המחובר.
5. רישום נתוני פלואורסצנטיות בזמן אמת
- הפעל את בלוק החום המסחרי ואפשר לו להגיע לטמפרטורה הרצויה.
- פעיל את המחשב בעל הלוח היחיד באמצעות ספק כוח סטנדרטי של 5 וולט המסופק עם רוב רכישות המחשבים בלוח יחיד. חבר את המחשב בעל הלוח היחיד למיקרו-בקר באמצעות microUSB לכבל USB.
- באמצעות מסך המגע, פתח את סקריפט פייתון שסופק. שנה את משתני measurement_time וה- serialPort לערכים הרצויים. שנה את פלט המשתנהפילפת לשם קובץ הנתונים שהתוכנית יוצרת. ודא ששם הקובץ מסתיים ב' .xlsx'.
- מקם שני צינורות PCR המכילים את התגובות שיש לפקח עליהם לתוך בלוק החום. ודא כי המיקום של צינורות PCR מיישר עם הערוצים האופטיים של הפלואורימטר ברגע שהוא ממוקם על בלוק החום.
- מניחים את הפלואורימטר על גבי בלוק החום עם צינורות PCR ממורכזים בין ארבעת היתדות הבלטה מכל ערוץ אופטי של הפלואורימטר. למדידות מיטביות, ודאו שהפלואורימטר המודפס בתלת-ממד מחובר היטב לבארות גוש החום.
- חבר באופן מאובטח את הפלואורימטר וחבר את מתאם ספק הכוח עבור נוריות ה- LED.
- השתמש במסך המגע כדי להפעיל את תוכנית Python. ממשק משתמש גרפי (GUI) מופיע על מסך ה- LCD ומודד את הפלואורסצנטיות בזמן אמת.
- שים לב למדידות הפלואורסצנטיות בזמן אמת לאורך זמן עבור שני צינורות PCR המוצגים למשתמש על GUI.
- לאחר שזמן הניסוי שנקבע על ידי המשתמש חלף, הרכישה נפסקת. הצג את המידות בקובץ נתוני הפלט שנשמרו במיקום המוגדר על-ידי המשתמש. כדי לסיים את המדידות מוקדם, לחץ על הלחצן שכותרתו "עצור רכישה" בממשק המשתמש.
Representative Results
לאחר ההרכבה, ניתן לאמת ביצועי פלואורימטר על ידי מדידת פלואורסצנטיות מסדרת דילול של צבע FITC. באיור 3A, מוצגות מדידות של צבע FITC בריכוזים של 0, 20, 40, 60 ו- 80 pg/μL שהוכנו ב- PBS 1x בשני הערוצים של התצורה הראשונה של הפלואורימטר. כל דגימה נמדדה שלוש פעמים עם חשיפת LED של 1.5 שניות במרווחים של 20 שניות. שני הערוצים של הפלואורימטר מראים תגובה ליניארית על פני הטווח הרצוי.
ישימות קלינית של הפלואורימטר הודגם עוד יותר באמצעות המערכת יחד עם בלוק חום יבש זמין מסחרית לבצע הגברה עם שתי טכנולוגיות הגברה isothermal: RPA ו RT-LAMP.
איור 3B מדגים את מהלך הזמן המופחת הבסיסי של פלואורסצנטיות שנמדד במהלך הגברה של 39 °C (39 °F) של 50 μL של תגובות בקרה חיוביות ושליליות בזמן אמת של RPA עבור DNA שליטה חיובית קיט המסופק בערכה מסחרית סטנדרטית ומוכן לפי הוראות היצרן. תגובות RPA, המייצרות רמה נמוכה יחסית של פלואורסצנטיות, נמדדו באמצעות התצורה הראשונה של הפלואורימטר שמשיגה דיכוי טוב יותר של אור עירור.
איור 3C מדגים את מדידת מסלול הזמן של מבחני RT-LAMP מותאמים אישית ב 65 °C (65 °F) ניצול N2, E1, ו As1e פריימר סטים המתוארים על ידי ג'אנג ואח'10, ו Rabe ו Cepko11. תגובות RT-LAMP מייצרות כמות גדולה יותר של פלואורסצנטיות ונמדדו באמצעות תצורת הפלואורימטר השנייה בעלות נמוכה יותר. אוליגונוקלאוטידים נרכשו והושקעו מחדש במאגר TE 2x בריכוז של 1 מ"מ. פריימר פנימי קדמי (FIP) ואוליגו פנימי אחורי (BIP) הוזמנו עם טיהור כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. כל סט פריימר (N2, E1, ו As1e) היה משולב כדי להפוך 1000 μL של תערובת 25x כדלקמן: 40 μL של FIP, 40 μL של BIP, 5 μL של F3, 5 μL של B3, 10 μL של LF, 10 μL של LB, ו 890 μL של 1x מאגר TE. כדי להרכיב כל תגובת RT-LAMP, μL אחד של כל ערכת פריימר נוסף 0.5 μL של צבע פלואורסצנטי 50x ו 12.5 μL של 2x תערובת הורים ונפח התגובה הועלה עד 20 μL עם מים ללא גרעין לפי הוראות היצרן. בקרת ה-RNA SARS-CoV-2 דוללה באופן סדרתי במים נטולי גרעין לריכוזים של 10, 100 או 1,000 עותקים ל- μL, ו- 5 μL נוספו לנפח תגובה כולל של 25 μL. אין בקרת מטרה (NTC) בשימוש בכל הניסויים היו מים ללא גרעין. תגובות RT-LAMP היו כיסוי עם 25 μL של ביולוגיה מולקולרית כיתה שמן מינרלי.
תגובות RPA ו- RT-LAMP הורכבו בשתי בארות של רצועת PCR בעלת פרופיל נמוך של 0.2 מ"ל וכתרים עם כובעים שטוחים אולטרה-קליריים. כל תגובת RPA ו- RT-LAMP הופעלה בטריפל. בכל הבדיקות, המיני פלואורימטר כימת בהצלחה את העלייה הזמנית של רמות הפלואורסצנטיות הקשורות להגברת ה- DNA.
איור 1: דיור אופטי ופלואורימטר מיניאטורי מורכב על גבי בלוק חום. (A) תרשים של דיור אופטי המציג רכיבים אופטיים הממוקמים בערוץ זיהוי אחד. (B) דיאגרמה של התצורה הראשונה של הפלואורימטר הזעיר לאחר ההרכבה. (C) תצלום של הדיור האופטי עם רכיבים אופטיים הממוקמים בערוץ זיהוי אחד. (ד)תצלום של פלואורימטר מיניאטורי מורכב ממוקם על גבי בלוק חום זמין מסחרית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמת הרכבה ובקרה חשמלית של הפלואורימטר הזעיר. A-J) מיקום שלב אחר שלב של הרכיבים האופטיים בדיור האופטי המודפס בתלת-ממד עבור תצורת המערכת הראשונה. (K) דיאגרמה חשמלית של הפלואורימטר הזעיר עבור שתי התצורות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידות מייצגות המתקבלות באמצעות הפלואורימטר הזעיר. (A) פלואורסצנטיות נמדדת לעומת ריכוז צבע FITC בשני הערוצים מראה תגובה ליניארית על פני הטווח הדינמי הרצוי. (B)פלואורסצנטיות בזמן אמת לעומת זמן להגברה איסותרמית של בקרות חיוביות ושליליות של ערכה זמינה מסחרית. הגברה מתרחשת כצפוי עבור הפקד החיובי. (C)פלואורסצנטיות בזמן אמת לעומת זמן להגברה איסותרמית של 50, 500 ו-5000 עותקים של SARS-CoV-2 RNA ודגימת NTC ממחיית RT-LAMP מותאמת אישית. הגברה מתרחשת כצפוי בסמוך לגבול הגילוי של ההגברה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מערכת 1 | מערכת 2 | |||
| פריט | כמות | מחיר כולל (USD) | כמות | מחיר כולל (USD) |
| רכיבים אופטיים | ||||
| עדשות | 6 | 158.14 | 6 | 158.14 |
| מראות | 2 | 244.56 | 2 | 60 |
| מסננים אופטיים | 4 | 200 | 6 | 5 |
| סכום ביניים | 602.7 | סכום ביניים | 223.14 | |
| תאורה וזיהוי | ||||
| נוריות | 2 | 72.62 | 2 | 72.62 |
| מנהל התקן LED | 1 | 11.49 | 1 | 11.49 |
| פוטודיודה | 2 | 50 | 2 | 50 |
| סכום ביניים | 134.11 | סכום ביניים | 134.11 | |
| אלקטרוניקה ותצוגה | ||||
| ארדינו ננו | 1 | 20.7 | 1 | 20.7 |
| פאי פטל | 1 | 35 | 1 | 35 |
| מסך LCD | 1 | 25 | 1 | 25 |
| לוח לחם מיני | 1 | 4 | 1 | 4 |
| ספק כוח 10V | 1 | 8.6 | 1 | 8.6 |
| סכום ביניים | 93.3 | סכום ביניים | 93.3 | |
| עלות כוללת (USD) | 830.11 | 450.55 | ||
טבלה 1: השוואת עלויות של שתי התצורות של הפלואורימטר הזעיר.
קובץ משלים 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl, ובבקשה לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: LCD_Screen_Holder.stl אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl, ו אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 6: System2_BuildInstructions.pdf אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ קידוד זה.
קובץ קידוד משלים 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ קידוד זה.
Discussion
המתואר כאן הוא קוד פתוח, בעלות נמוכה, מודולרי, פלואורימטר נייד לגילוי פלואורסצנטיות כמותית של תגובות הגברה isothermal. פרויקטי קוד פתוח מאפשרים תחזוקה מהירה וזולה עם חלקי חילוף זמינים ומאפשרים למשתמשים את הגמישות להתאים את המערכת לצרכיהם על בסיס עיצוב מודולרי. פרוטוקול זה מתאר את תהליך הרכבת הרכיבים המכניים, האופטיים והחשמליים ואימות הביצועים האופטיים. יתר על כן, הגמישות של הפלואורימטר כדי לפקח על שני סוגים שונים של מבחני הגברה איזותרמיים עם דרישות טמפרטורה, נפח ופלואורסצנטיות שונות באופן משמעותי, RPA exo ו- RT-LAMP, הודגם. RPA מבוצע ב 39 °C (69 °F) ב 50 תגובות μL המשתמשות בדיקה ספציפית לרצף FAM מתויג עבור יצירת פלואורסצנטיות, בעוד RT-LAMP מבוצע ב 65 °C (65 °F) בנפח תגובת μL 25 ומשתמש צבע intercalating לדווח על נוכחות של ה-DNA מוגברת. מכיוון שמדידות פלואורסצנטיות מתבצעות דרך החלק העליון של צינורות PCR עם כובעים שטוחים, הפלואורימטר מסוגל לזהות פלואורסצנטיות משני נפחי ההסתעפות, ודרישות החום מוגבלות רק על ידי בלוק החום המסחרי שנבחר. יתר על כן, עוצמת הפלואורסצנטיות המיוצרת ב- RT-LAMP היא כמעט בסדר גודל גדול מזה המיוצר ב- RPA, בשל שיטות מבוססות צבע לעומת בדיקה של ייצור אותות פלואורסצנטיים. עם זאת, הטווח הדינמי של החיישן האופטי שנבחר יכול לזהות ולכמת הן את האותות והן את אלגוריתמי החיסור הבסיסיים מסבירים את ההבדלים הללו כדי לייצר קריאות פלואורסצנטיות אמינות.
כדי להקל על הפצת טכנולוגיה ולמזער את עלות התחזוקה הפוטנציאלית, הופעל עיצוב מודולרי התואם לתנורים הזמינים באופן נרחב במסגרות שונות. בפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בתנור בלוק יבש משותף; אותו עיצוב אופטי וחשמלי יכול להיות מותאם בקלות עבור תנורי חימום מסחריים אחרים זמינים. אם יש להשתמש בתנור בלוק יבש נוסף, יידרשו שינויים מינימליים בתכנון הדיור בתלת-ממד. באופן ספציפי, היתדות התחתונות של קבצי STL המתחם האופטי חייב להיות שונה כדי להבטיח יישור נכון עם בארות של בלוקי חום מסחריים אחרים. בעוד שהמארזים המוצגים בדוגמאות הודפסו במדפסת תלת-ממד נמוכה יחסית (ראה טבלת חומרים),יש להקפיד לוודא שרזולוציית המדפסת ו/או טולרנס ההדפסה מתאימים לרכיבים האופטיים ולתוספות הליכי המשנה. בקבצי STL שסופקו, נוספה עמידות של 0.01-0.02 אינץ' משני צדי הרכיבים האופטיים בכיוונים הרדיאליים והאקסיאליים בהתבסס על הממדים שצוינו על-ידי היצרן. פעולה זו מבטיחה שכל הרכיבים האופטיים יתאימו בצורה מאובטחת להדפסה ושהמארז חוסם לחלוטין את הכניסה או הבריחה של אור עודף. כדי להבטיח התאמה נכונה של הלחיצה עבור התוספות המשורשרות, סטייה דומה של 0.01-0.02 אינץ' הופטרה מהקוטר שסופק על-ידי היצרן בקובץ ה- CAD.
תגובות RPA נוטרו בהצלחה באמצעות תצורת הפלואורימטר הראשונה, בעוד שניתן היה לפקח על תגובות RT-LAMP באמצעות כל אחת מהתצורות. דחיית האור התועה המשופרת של התצורה הראשונה הייתה הכרחית כדי לפקח על רמות נמוכות של פלואורסצנטיות המיוצר על ידי החללית פלואורוגנית בתגובות RPA. לעומת זאת, RT-LAMP משתמש בצבע בין-צירי ליצירת אותות, וכתוצאה מכך עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר התואמת לטווח הדינמי הנמוך יותר של התצורה השנייה באמצעות רדידי מסנן צילום. משתמשים צריכים לבחור את תצורת הפלואורימטר התואמת לאות הפלואורסצנטי המייצר צבע בין רכיבים או בדיקה פלואורוגנית של הבדיקה שלהם.
מגבלה אחת של מערכת זו היא כי החימום מסופק על ידי בלוק חום זמין מסחרית מופעל באמצעות שקע קיר סטנדרטי. מערכת זו יכולה להיות מפותחת עוד יותר לשימוש באזורים חסרי גישה אמינה לחשמל על ידי שילוב מארזי סוללות ניידים ונטענים כפי שמוצג על ידי קבוצות אחרות12. מגבלה נוספת היא התפוקה הנמוכה יחסית של המערכת, המאפשרת מדידת פלואורסצנטיות בו זמנית של שתי דגימות בלבד בכל פעם. הדפסים מרובים של המארז ניתן למקם על גבי אותו בלוק חום כדי להגדיל את התפוקה; עם זאת, חיישן האור המשמש יש רק ארבע כתובות ייחודיות I2C. פעולה זו מגבילה את המספר המרבי של דגימות שניתן למדוד בו זמנית לארבעה. חיישן אור שונה עם מספר גדול יותר של כתובות I2C ייחודיות נדרש כדי להגדיל עוד יותר את התפוקה.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
תודה מיוחדת לצ'לסי סמית', מייגן צ'אנג, אמילי ניושאם, סאי פול וכריסטופר גו על עזרתם בהכנת מדגם. המחברים מודים לקרוליין נוקסון על תיקון כתב היד. מימון עבור עבודה זו סופק מהעם האמריקאי על ידי USAID באמצעות מענק מחקר IAVI CCID 9204 תחת פרס AID-OAA-A16-00032 בין IAVI ו USAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED - 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
References
- Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
- Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).
