Summary
실시간 정량적 정량적 핵산 증폭을 수행하기 위해 많은 저가 히터와 호환되는 오픈 소스, 모듈형 형광계를 구축하기 위한 상세한 지침이 제공됩니다.
Abstract
핵산을 검출하고 정량화하는 전통적인 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의존하며 앰플론의 통합형 형광 검출을 통해 고가의 열순환기를 사용해야 합니다. 이더스핵산 증폭 기술은 열순환의 필요성을 제거한다. 그러나, 제품의 형광 기반 검출은 여전히 실시간, 정량적 결과에 필요합니다. 통합형 형광 검출기능이 있는 여러 휴대용 이더스컬 히터가 상용화되었습니다. 그러나 이러한 장치의 비용은 리소스 제한 설정에서 광범위한 채택에 상당한 장벽으로 남아 있습니다. 여기에 설명된 것은 기성 부품으로 구성된 모듈식 저비용 형광계의 설계 및 조립을 위한 프로토콜입니다. 컴팩트한 3D 프린팅 하우징에 동봉된 불소계는 PCR 튜브를 들고 있는 시판되는 열 블록 위에 배치되도록 설계되었습니다. 여기서 설명된 형광계는 형광이소이소(FITC) 염료를 검출하도록 최적화되었지만, 시스템은 실시간 핵산 증폭 반응에서 리포터로서 일반적으로 사용되는 염료와 함께 사용하기 위해 수정될 수 있다. 시스템의 임상 적용성은 두 가지 이더스말 증폭 기술로 실시간 핵산 검출을 수행함으로써 입증된다: 상용 키트및 역전사 루프 매개 이더스말 증폭(RT-LAMP)의 검출을 위한 재조합 폴리머라제 증폭(RPA)은 SARS-CoV-2 RNA의 임상적으로 의미 있는 수준의 검출을 위한 것이다.
Introduction
이더스말 증폭 기술은 핵산 검출에 널리 사용된다. 열순환을 필요로 하는 기존의 PCR 접근법과 비교하여, 이소성 증폭을 통해 핵산 증폭이 단일 온도에서 발생하여 더 빠른 결과 및 억제제1,2의더 나은 내성을 가능하게 한다. 이더실 증폭의 또 다른 주요 이점은 감소된 계측 복잡성입니다. 대부분의 이더체 증폭 반응은 열 블록및 검출 양식-형광 모니터링 또는 엔드포인트 검출을 통한 실시간 검출, 예를 들어 측면 흐름 또는 겔 전기포진3,4에의해서만 요구된다. 실시간 형광 검출은 특정 이중 가닥 DNA 서열의 존재에서 활성화되는 이중 가닥 DNA 또는 담금질 형광 프로브의 존재에서 활성화되는 염료를 상호 복제하여 생성된 형광검출을 통해 달성된다.
시판되는 벤치탑은 더이상 형광계가 존재하지만, 많은 분석 구현에 대한 사용자 정의부족. 예를 들어, 많은 장치에는 특정 또는 회사에서 제공하는 소모품이 필요하거나, 선호하는 공급업체를 추천하거나, 독점 소프트웨어를 사용하여 광고된 결과를 얻을 수 있습니다. 이러한 시스템의 대부분은 5,000달러 이상의 비용이 들며, 이는 자원 제한 설정에서 광범위하게 사용할 수 있는 상당한 장벽을 나타냅니다. 또한, 자원이 부족한 환경에서 사용자는 열악한 환경 조건, 예비 부품의 약한 공급망, 유지 보수 및 수리에 필요한 특수 공구로 인해 고자원 설정을 위해 설계된 장비를 유지 관리하는 데 어려움을 겪고있습니다. 이러한 요구를 충족시키기 위해, 여기에 설명된 두 가지 선택적 구성이 있는 컴팩트한 3D 인쇄 하우징(그림1A-C)에둘러싸인 상용 부품으로 구성된 모듈식 및 저비용 플루오리미터의 설계 및 조립이 있습니다. 이 장치의 첫 번째 구성은 시판되는 유리 필터와 이색 거울을 사용하여 과도한 배경 광을 차단하고 총 조립 비용이 $830 USD입니다. 이러한 필터는 형광 기반 이미징 시스템에서 일반적으로 사용되지만, 고가의 고급 광학 필터 호일을 대체하는 것은 이전에 핵산 검출6을허용하는 것으로 나타났다. 불소계의 두 번째 구성은 이러한 저렴한 필터를 통합하고 이색 거울을 φ1/2" 빔 스플리터로 대체하여 시스템의 전체 비용을 $830에서 $450 USD로 줄입니다.
어셈블리의 대표적인 이미지는 도 1 및 도 2의첫 번째 구성에 대해 표시되지만 두 번째 구성에 대한 유사 이미지는 보충 파일 6에서찾을 수 있습니다. 특수 광학 정렬의 필요성을 피하기 위해 광학 시스템은 각 광학 부품을 배치할 영역을 지정하고 상대적으로 낮은 엔드 3D 프린터로 만들 수 있어 설계를 광범위하게 사용할 수 있습니다. 두 구성의 구성 및 어셈블리의 유일한 차이점은 3D 프린팅에 사용되는 파일과 인클로저에 배치된 광학 부품입니다. 두 시스템에 대한 3D 인쇄 인클로저의 외부 치수는 동일합니다. 두 시스템의 비용 비교는 표 1에표시됩니다.
도 1A에도시된 바와 같이, 작은 폼 팩터를 유지하기 위해, 불소계는 Φ1/2"(~12.5mm) 광학으로 구성되며, PCR 튜브의 상단을 통해 신호를 측정하기 위해 배치되는 컴팩트한 조명 및 검출과 결합된다. 도 1의 시스템은 FITC 및 SYBR 및 SYTO-9와 같은 밀접한 관련이 있는 염료를 포함하여 각각 490nm 및 525 nm 근처의 피크 여기 및 방출 파장으로 염료를 검출하도록 설계되었으며, 이는 일반적으로 실시간 핵산 증폭 반응7,8에서리포터로 사용된다. 여기 소스, 광학 필터 및 검출기는 원하는 대로 다른 형광 염료와 호환되는 구성 요소로 쉽게 대체 될 수 있습니다. 핵산 증폭 반응은 전형적으로 PCR 튜브에서 수행되며, 플루오리미터는 PCR튜브(도 1D)를보유하는 상업적으로 이용 가능한 열 블록 위에 배치되도록 설계되어 이더스암 반응의 실시간 모니터링을 허용한다. 적절한 열 블록은 대부분의 생물 의학 실험실에서 사용할 수 있으며 $ 500 USD 미만으로 구입할 수 있습니다.
이미징 기술을 제어하기 위한 저비용 치료 대안을 제공하기 위해 단일 보드 컴퓨터를 사용하는 것은 이전에입증되었습니다 9. 이 프로토콜에서 단일 보드 컴퓨터 기반 그래픽 사용자 인터페이스(그림 1D)는실시간 데이터 로깅 및 치료 시점에서 결과의 표시를 용이하게하는 데 사용되어 랩톱 컴퓨터가 데이터를 처리하거나 시각화 할 필요가 없습니다. 형광 측정은 광 센서에서 마이크로 컨트롤러로 I2C 프로토콜을 통해 전송된 다음 직렬 통신을 통해 단일 보드 컴퓨터에 제공되었습니다. 조명 및 데이터 전송을 위한 전기 연결은 소형 브레드보드의 단순화된 배선 및 납땜을 통해 제공되어 특수 인쇄 회로 기판(PCB)의 필요성을 부정했습니다. 불소계를 실행하는 데 필요한 소프트웨어는 오픈 소스 소프트웨어 프레임워크를 통해 사용할 수 있으며 장치를 실행하는 데 필요한 코드는 추가 코딩 파일에제공됩니다. 완전한 형광계는 $450에서 $830 USD 사이로 조립될 수 있으며, 결과는 핵산의 실시간 이더스플루암스를 모니터링하기 위해 정확하고 신뢰할 수 있는 형광 측정을 제공한다는 것을 보여줍니다.
Protocol
1. 준비 단계 : 3D 인쇄 및 납땜
참고: 이 프로토콜에 설명된 광학 시스템은 표준 드라이 블록 히터용으로 설계되었습니다.
- 첫 번째 구성을 만들려면 3D는 보충 파일 1, 2 및 3으로 제공되는 CAD 파일을 각각 인쇄합니다.
- 두 번째 구성을 만들려면 3D는 보충 파일 3, 4 및 5로제공되는 CAD 파일을 각각 인쇄합니다.
참고: 이러한 부품은 지지대로 인쇄되도록 설계되었습니다. 이 가이드에서는 최대 110°C의 온도를 받은 후 형태를 유지할 수 있는 검은색 폴리카보네이트 필라멘트가 사용됩니다. 일반적으로, 유의한 변형 없이 원하는 이더스말 반응의 온도로 가열될 수 있는 모든 물질을 사용할 수 있다. 내부 반사 및 주변 광 간섭의 효과를 최소화하려면 검정색 또는 다른 어두운 색의 재질을 권장합니다. - 두 개의 샘플을 병렬 모니터링하기 위해 두 개의 광-디지털 센서 평가 모듈을 준비합니다. 센서 테스트 보드 중 하나에서 R4 저항기를 제거하고 PCB의 R4 영역오른쪽 패드에서 점퍼 와이어를 PCB의 R1 영역의 상단 패드로 납땜합니다. 이렇게 하면 센서의 I2C 주소가 변경되므로 두 센서를 동시에 측정할 수 있습니다.
참고: 사용되는 센서는 USB 어댑터 보드와 광 센서가 포함된 센서 테스트 보드의 두 개의 PCB로 구성됩니다. 이 장치에는 센서 테스트 보드만 필요합니다. - 솔더 와이어는 두 개의 발광 다이오드(LED)의 각에 연결됩니다. LED의 "1"이라고 표시된 패드에 빨간색 와이어(positive)를 연결하고 LED의 "2"라고 표시된 패드에 검은색 와이어(negative)를 연결합니다. LED 뒷면에 얇은 열 접착제층을 적용하고 LED를 엔드 캡 위에 놓고 열 접착제가 치료될 때까지 기다립니다. 끝 캡의 반대편에 방열판을 추가합니다.
참고: 인클로저에 밀봉되기 전에 LED를 테스트할 때 적절한 청색광 차단 눈 보호 기능을 착용해야 합니다. - 두 번째 구성을 만들려면 파란색 여기 호일 시트에서 1/4 인치 직경 의 두 개의 원과 가위 또는 면도날이있는 노란색 방출 호일 시트에서 4 개의 1/4 인치 직경 원을 잘라냅니다.
- M2.5 육각형 인서트를 'LCD_Screen_Holder.stl' 부분의 기울어진 부분에 있는 4개의 구멍각각에 삽입합니다.
2. 광학 조립
- 3/16 인치 길이의 4-40 스레드 인서트를 'Optics_Enclosure_Bottom.stl' 부품 상단의 구멍에 놓습니다. 도 2A에표시된 대로 1/4인치 길이의 4-40 스레드 인서트를 3D 인쇄 부품의 다른 모든 구멍에 배치합니다.
- 센서 테스트 보드를 하우징의 상단 캐비티에 삽입하고 5개의 핀이 상단을 향하고 장치의 중심 축에 가장 가깝습니다. 센서 테스트보드(그림 2B)의구멍을 통해 3/16 인치 길이의 4-40 나사로 고정하십시오.
- 센서 테스트 보드 아래 섹션에 20mm 초점 길이 렌즈 중 하나를 놓고 볼록한 면을 장치의 바닥을 향하고 테스트보드(그림 2C)에서멀리 떨어져 있습니다.
- 첫 번째 구성을 만들려면, 이전 단계에 배치된 20mm 초점 길이렌즈(그림 2D)아래 다음 섹션에 긴 패스 필터를 배치한다. 두 번째 구성을 만들려면 두 개의 노란색 방출 필터 호일을 렌즈 아래 섹션에 배치합니다.
- 첫 번째 구성을 만들려면 제조업체가 지정한 필터 방향을 관찰하면서 대각선 섹션에 대각선 미러를배치합니다(그림 2E). 두 번째 구성을 만들려면 빔 스플리터를 대각선 섹션에 배치합니다. 빔 스플리터에는 특정 방향이 필요하지 않습니다.
- 초구체 20mm 초점 길이 렌즈를 장치 상단을 가리키는 볼록 측과 함께 이색 거울(또는 구성에 따라 빔 스플리터)아래 섹션에 놓습니다(도2F).
- 첫 번째 구성을 만들려면 이색 거울의 오른쪽에 여기 필터를 배치하여 화살표가 이색거울(그림 2G)을향해 가리키는지 확인합니다. 두 번째 구성을 만들려면 빔 스플리터의 오른쪽에 있는 섹션에 파란색 여기 필터 호일 1개를 배치합니다.
- 15mm 초점 길이 렌즈를 이색거울(도 2H)을향한 볼록 측과 함께 여기 필터의 오른쪽에 놓습니다.
- LED가 디크로이크 미러(또는 구성에 따라 빔 스플리터)를 향하여 인쇄의 나머지 섹션에 LED를 배치합니다. LED에서 이어지는 두 개의 전선이 오목한 채널에 삽입되어 인쇄가 단단히 닫히도록 합니다.
- 3D 프팅 파트의 반대편에 대해 2.3-2.9를 반복한다(도2I).
- 캡슐화의 상단 절반의 압출 부분을 반케이스의 오목한 홈에 배치하여 인쇄 의 상단에 있는 인쇄의 빈 면을 광학 구성요소로 닫습니다. 3/8 인치 길이의 4-40 나사(그림 2J)와함께 두 개의 인쇄 된 부품을 고정하십시오.
참고: 두 개의 인쇄된 부품이 완전히 닫히지 않으면 길 잃은 흥분 광이 광학 하우징에서 빠져나간 수 있습니다. 적절한 씰이 달성될 때까지 적절한 청색광 차단 눈 보호 기능을 착용하십시오. 과도한 빛이 빠져나가지 때까지 인클로저를 다시 밀봉합니다.
3. 전자 및 터치 스크린 조립
- 두 개의 미니 브레드보드를 함께 연결한 다음 마이크로 컨트롤러를 브레드보드 중 하나에 놓습니다. 마이크로 컨트롤러의 microUSB 포트가 바깥쪽으로 직면하도록 합니다.
- LED 변조를 연결하려면 LED(+) 드라이버의 CTL 핀을 마이크로 컨트롤러의 디지털 핀과 LED 드라이버의 LED(-) 핀을 마이크로 컨트롤러의 GND 핀에 연결합니다.
- 브레드보드 뒷면의 플라스틱 커버를 제거합니다. 브레드보드의 접착제 백업을 3D 인쇄 부품에 눌러 'LCD_Screen_Holder.stl' 인쇄부품의 뒷면 부분에 결합된 브레드보드를 부착합니다.
- 액정 디스플레이(LCD) 스크린 홀더를 1인치 길이의 4-40 나사로 2부로 조립된 광학 인클로저에 내부의 조립된 브레드보드를 고정합니다.
- LED 전원 공급 장치를 연결하려면 LED 드라이버의 LED(+) 핀을 첫 번째 LED의 양수 와이어에 연결합니다. 첫 번째 LED의 음수 와이어를 브레드보드의 두 번째 LED의 양수 와이어에 연결합니다. 두 번째 LED의 음수 와이어를 LED 드라이버의 LED(-) 핀에 연결합니다.
참고: 첫 번째 또는 두 번째 LED의 순서는 임의적입니다. - LED 드라이버 전원 공급 장치를 연결하려면 10V 전원 공급 장치의 양수 및 음수 와이어를 LED 드라이버의 VIN+ 및 VIN-핀에 각각 연결합니다. (배럴 잭에서 2핀 어댑터에 사용되었습니다.)
- 센서 테스트 보드 전원 공급 장치 및 데이터 전송을 연결합니다. 센서 테스트 보드의 핀은 SCK, SDA, VDUT 및 GND에 만 4개의 핀만 사용됩니다. 4핀 암컷을 남성 점퍼 와이어에 가져가서 LCD 홀더 프린트 오른쪽 상단의 틈새를 통해 라이트-디지털 센서 테스트 보드의 핀을 미니 브레드보드에 연결합니다.
- 브레드보드에서 마이크로컨트롤러의 3.3V 핀과 두 테스트 보드의 VDUT 핀 과 같은 연결체가 제자리에 있는지 확인합니다. 마이크로 컨트롤러의 GND 핀과 두 테스트 보드의 GND 핀; 마이크로 컨트롤러의 아날로그 4 (A4) 핀과 두 테스트 보드의 SDA 핀; 마이크로 컨트롤러의 아날로그 5(A5) 핀과 두 테스트 보드의 SCK 핀.
참고: I2C통신은 라이트 센서에 사용되기 때문에 두 센서의 SCK 및 SDA 핀을 모두 마이크로 컨트롤러의 동일한 핀으로 라우팅할 수 있습니다. - 4개의 M2.5 나사로 LCD 화면 홀더에 단일 보드 컴퓨터를 고정합니다. 단일 보드 컴퓨터의 HDMI 및 전원 어댑터 포트가 위쪽으로 면이 되고 단일 보드 컴퓨터가 3D 인쇄 부품에 중심이 되도록 합니다.
- 터치스크린 디스플레이를 터치스크린 지침에 따라 단일 보드 컴퓨터에 연결한 다음 단일 보드 컴퓨터의 HDMI 포트를 터치스크린의 HDMI 포트에 연결합니다.
4. 소프트웨어 설치
- 설치하고 마이크로 컨트롤러에 보충 코딩 파일 1에 제공되는 사용자 정의 스케치 "MiniFluorimeter_2Diode.ino"를 업로드하려면 웹 편집기를 사용합니다. 라이브러리 관리자를 사용하여 "ClosedCube OPT3002" 라이브러리를 설치해야 합니다.
- 변수 led_A_pin 3.3 단계(전자 및 터치스크린 어셈블리 섹션)에 사용되는 디지털 핀 의 수로 변경합니다.
- 변수 노출시간의 값을 변경하여 형광 측정을 획득할 때 LED가 켜지는 밀리초 수를 조정합니다. 변수 led_A_Interval 값을 변경하여 LED 노출 사이의 밀리초 수를 조정합니다.
- 노출 시 LED의 밝기를 조정하기 위해 변수 led_Power 0에서 1 사이의 숫자로 변경합니다. 0은 최대 밝기양을 제공하며, 하나는 가장 낮은 밝기를 제공합니다.
- 3.5인치 디스플레이와 함께 제공된 제조업체의 지침을 따라 터치스크린을 통해 디스플레이를 제어할 수 있는 기능을 켭니다.
참고: 원하는 경우 3.5인치 화면을 터치스크린 기능이 없는 모니터로 사용할 수 있으며 단일 보드 컴퓨터의 USB 포트에 키보드와 마우스를 부착하여 단일 보드 컴퓨터를 제어할 수 있습니다. - 보충 코딩 파일 2에서 단일 보드 컴퓨터의 원하는 위치에 "MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" 파일을 다운로드합니다.
- 파이썬의 작동 버전이 단일 보드 컴퓨터에 설치되어 있는지 확인합니다. 파이썬 3.7은 제공된 파이썬 모듈에 사용되었지만 제공된 스크립트를 적절하게 변경하여 안정적인 파이썬 버전을 사용할 수 있습니다. Python 프로그램에 필요한 라이브러리를 단일 보드 컴퓨터에 설치합니다.
- 측정을 원하는 시간으로 measurement_time 변수를 변경합니다. 프로그램은 획득을 종료하고 원하는 시간이 경과한 후 종료됩니다. GUI를 사용하면 사용자 인터페이스의 단추를 통해 인수를 종료할 수 있습니다.
- 변수 직렬포트를 연결된 마이크로 컨트롤러의 직렬 주소로 변경합니다.
5. 실시간 형광 데이터 기록
- 상업용 열 블록을 켜고 원하는 온도에 도달 할 수 있습니다.
- 대부분의 단일 보드 컴퓨터 구매와 함께 제공되는 표준 5 V 전원 공급 장치로 단일 보드 컴퓨터에 전원을 공급합니다. 단일 보드 컴퓨터를 마이크로 컨트롤러에 마이크로 USB를 USB 케이블에 연결합니다.
- 터치스크린을 사용하여 제공된 파이썬 스크립트를 엽니다. measurement_time 및 직렬포트 변수를 원하는 값으로 변경합니다. 변수 출력파일 경로를 프로그램이 생성하는 데이터 파일의 이름으로 변경합니다. 파일 이름이 '.xlsx'로 끝나는지 확인합니다.
- 열 블록에 모니터링할 반응을 포함하는 두 개의 PCR 튜브를 배치합니다. PCR 튜브의 배치가 열 블록에 배치되면 형광계의 광학 채널과 정렬되는지 확인합니다.
- 불소계의 각 광학 채널에서 압출되는 네 개의 못 사이에 중심을 두는 PCR 튜브를 열 블록 위에 놓습니다. 최적의 측정을 위해 3D 인쇄 형광계가 열 블록의 우물에 단단히 부착되었는지 확인합니다.
- 형광계를 단단히 부착하고 LED용 전원 공급 장치를 연결합니다.
- 터치스크린을 사용하여 파이썬 프로그램을 시작합니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)가 LCD 화면에 나타나고 실시간 형광을 측정합니다.
- GUI에서 사용자에게 표시되는 두 PCR 튜브에 대해 시간이 지남에 따라 실시간 형광 측정을 관찰합니다.
- 사용자가 결정한 실험 시간이 경과하면 획득이 중단됩니다. 사용자 정의 위치에 저장된 출력 데이터 파일의 측정값을 봅니다. 측정을 조기에 종료하려면 사용자 인터페이스에서 "수집 중지"라고 표시된 단추를 클릭합니다.
Representative Results
일단 조립되면 FITC 염료의 희석 계열에서 형광을 측정하여 형광계 성능을 검증할 수 있습니다. 도 3A에서,플루오리미터의 첫 번째 구성의 두 채널에서 1x PBS로 제조된 0, 20, 40, 60 및 80 PG/μL의 농도에서 FITC 염료의 측정이 도시된다. 각 샘플은 20s 간격으로 1.5s의 LED 노출로 세 번 측정하였다. 형광계의 두 채널모두 원하는 범위에 걸쳐 선형 반응을 보여 준다.
형광계의 임상 적용성은 RPA 및 RT-LAMP의 두 가지 이더스플루 증폭 기술로 증폭을 수행하기 위해 시판되는 건식 열 블록과 함께 시스템을 사용하여 더욱 입증되었다.
도 3B는 표준 상용 키트에 제공된 키트 양성 제어 DNA에 대한 실시간 RPA 양성 및 음성 제어 반응의 50 μL의 39°C 증폭 중에 측정된 형광의 기준차감 시간 과정을 시연하고 제조업체의 지침에 따라 제조되었다. 비교적 낮은 수준의 형광을 생성하는 RPA 반응은, 흥분광의 더 나은 억제를 달성하는 형광계의 첫번째 구성을 사용하여 측정되었습니다.
도 3C는 장외10,라베 및세코(11)에의해 기술된 N2, E1 및 As1e 프라이머 세트를 활용하여 65°C에서 맞춤형 RT-LAMP 분석의 시간 과정 측정을 시연한다. RT-LAMP 반응은 더 많은 양의 형광을 생성하고 두 번째 저비용 형광계 구성을 사용하여 측정하였다. 올리고뉴클레오티드는 1mM 농도에서 2배 TE 완충제에서 구입및 재중단되었다. 전방 내부 프라이머(FIP) 및 후방 내부 프라이머(BIP) 올리고는 고성능 액체 크로마토그래피 정제로 주문하였다. 각 프라이머 세트(N2, E1 및 As1e)는 25x 믹스의 1000 μL을 만들기 위해 결합되었다: FIP40 μL, BIP40 μL, F3 5 μL, B3 5 μL, LF 10 μL, LB 10 μL, 1x 1x 1x 1x 의 890 μL. 각 RT-LAMP 반응을 조립하기 위해 각 프라이머 세트의 1 μL을 50x 형광염의 0.5 μL과 2x 마스터 믹스의 12.5 μL에 첨가하고 반응 부피는 제조업체의 지침에 따라 핵이 없는 물로 최대 20 μL까지 증가시켰다. SARS-CoV-2 RNA 제어는 μL당 10, 100 또는 1,000부 의 농도로 뉴클레아제없는 물로 연일 희석되었고, 5 μL은 25 μL의 총 반응 부피에 추가되었다. 모든 실험에 사용되는 표적 제어(NTC)는 핵이 없는 물이었다. RT-LAMP 반응은 분자 생물학 급 미네랄 오일의 25 μL로 오버레이되었다.
RPA 와 RT-LAMP 반응은 0.2 mL 로우 프로파일 8 튜브 PCR 스트립의 두 개의 우물에서 조립되었으며 매우 명확한 플랫 캡으로 덮여 있었습니다. 각 RPA 및 RT-LAMP 반응은 삼중에서 실행되었습니다. 모든 테스트에서, 미니 형광계는 DNA 증폭과 관련된 형광 수준의 현세적 증가를 성공적으로 정량화시켰다.
그림 1: 광학 하우징 및 조립된 소형 형광계가 열블록 위에 배치된 광학 부품을 하나의 검출 채널에 표시한 광학 하우징의 다이어그램. (B)어셈블리 다음 소형 형광계의 첫 번째 구성의 다이어그램. (C)하나의 검출 채널에 배치 광학 부품광학 하우징의 사진. (D)조립된 소형 형광계의 사진은 시판되는 열블록 위에 놓인다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 소형 형광계의 조립 및 전기 제어 다이어그램. A-J)제1 시스템 구성을 위한 3D 프린팅 광학 하우징에서 광학 부품의 단계별 배치. (K)두 구성모두에 대한 소형 형광계의 전기 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 소형 형광계로 얻은 대표적인 측정값. (A)측정형 형광 대 FITC 염료 농도는 원하는 동적 범위에 걸쳐 선형 반응을 나타낸다. (B)실시간 형광 대 시판기 키트의 양성 및 음수 제어의 이더스플루 증폭에 대한 시간. 증폭은 양수 제어에 대해 예상대로 발생합니다. (C)사용자 정의 RT-LAMP 분석에서 SARS-CoV-2 RNA 및 NTC 샘플의 50, 500 및 5000의 이소레말라 증폭에 대한 실시간 형광 및 시간. 증폭은 분석의 검출 한계 에 가깝게 예상대로 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시스템 1 | 시스템 2 | |||
| 항목 | 양 | 총 가격(USD) | 양 | 총 가격(USD) |
| 광학 부품 | ||||
| 렌즈 | 6 | 158.14 | 6 | 158.14 |
| 거울 | 2 | 244.56 | 2 | 60 |
| 광학 필터 | 4 | 200 | 6 | 5 |
| 소계 | 602.7 | 소계 | 223.14 | |
| 조명 및 감지 | ||||
| LED | 2 | 72.62 | 2 | 72.62 |
| LED 드라이버 | 1 | 11.49 | 1 | 11.49 |
| 광다이오드 | 2 | 50 | 2 | 50 |
| 소계 | 134.11 | 소계 | 134.11 | |
| 전자 제품 및 디스플레이 | ||||
| 아두이노 나노 | 1 | 20.7 | 1 | 20.7 |
| 라즈베리 파이 | 1 | 35 | 1 | 35 |
| LCD 화면 | 1 | 25 | 1 | 25 |
| 미니 브레드보드 | 1 | 4 | 1 | 4 |
| 10V 전원 공급 장치 | 1 | 8.6 | 1 | 8.6 |
| 소계 | 93.3 | 소계 | 93.3 | |
| 총 비용 (USD) | 830.11 | 450.55 | ||
표 1: 소형 형광계의 두 구성의 비용 비교.
추가 파일 1 : System1_Optics_Enclosure_Top.stl이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 파일 2 : System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl, 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 파일 3 : LCD_Screen_Holder.stl이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 파일 4 : System2_Optics_Enclosure_Top.stl이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 파일 5 : System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl, 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 파일 6 : System2_BuildInstructions.pdf이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 코딩 파일 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino이 코딩 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 코딩 파일 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py 이 코딩 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명된 것은 이소레말 증폭 반응의 정량형 형광 검출을 위한 오픈 소스, 저비용, 모듈식, 휴대용 형광계입니다. 오픈 소스 프로젝트는 쉽게 사용할 수 있는 교체 부품으로 빠르고 저렴한 유지 보수를 용이하게 하고 모듈식 설계를 기반으로 시스템을 필요에 맞게 유연하게 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기계, 광학 및 전기 부품을 조립하고 광학 성능을 검증하는 프로세스를 설명합니다. 또한, 유상각기의 유연성이 현저하게 다른 온도, 부피 및 형광 요구 사항인 RPA 엑소 및 RT-LAMP를 통해 두 가지 유형의 이더스플루암스 에세이를 모니터링하는 것이 입증되었다. RPA는 형광 발생을 위한 서열 특이적 FAM 태그 프로브를 활용하는 50 μL 반응에서 39°C에서 수행되며, RT-LAMP는 25μL 반응 부피에서 65°C에서 수행되고 상호 확장염염을 사용하여 증폭된 DNA의 존재를 보고한다. 형광 측정은 평평한 캡을 가진 PCR 튜브의 상단을 통해 이루어지기 때문에 형광계는 분석 물량 모두에서 형광을 감지 할 수 있으며 열 요구 사항은 선택한 상용 열 블록에 의해서만 제한됩니다. 더욱이, RT-LAMP에서 생성된 형광 강도는 형광 신호 발생의 염료 대 프로브 기반 방법으로 인해 RPA에서 생성된 것보다 크기가 크다. 그러나, 선택한 광학 센서의 동적 범위는 신호와 기준 감산 알고리즘이 이러한 차이를 모두 감지하고 정량화하여 신뢰할 수 있는 형광 판독값을 생성할 수 있다.
기술 보급을 용이하게 하고 잠재적인 유지 보수 비용을 최소화하기 위해 다양한 환경에서 널리 사용되는 히터와 호환되는 모듈식 설계가 사용되었습니다. 현재 프로토콜에서 공통의 드라이 블록 히터가 사용되었습니다. 동일한 광학 및 전기 설계를 다른 상용 히터에 쉽게 조정할 수 있습니다. 다른 드라이 블록 히터를 사용할 경우 3D 하우징 설계의 최소한의 변화가 필요합니다. 특히, 광학 인클로저 STL 파일의 하단 페그는 다른 상업용 열 블록의 우물과 적절한 정렬을 보장하기 위해 수정해야합니다. 예제에 표시된 인클로저는 상대적으로 낮은 수준의 3D 프린터(재료 표참조)에 인쇄되었지만 프린터 해상도 및/또는 인쇄 허용 오차가 광학 부품 및 스레드 인서트를 수용하기에 적합한지 확인하기 위해 주의해야 합니다. 제공된 STL 파일에서는 제조업체가 지정한 치수를 기준으로 방사형 및 축 방향의 광학 부품의 양쪽에 0.01-0.02 인치의 허용 오차가 추가되었습니다. 이를 통해 모든 광학 부품이 인쇄 내에서 안전하게 장착되고 인클로저가 과도한 빛이 들어오거나 도주하지 못하도록 완전히 차단합니다. 스레드 인서트에 적합한 프레스 적합을 보장하기 위해 CAD 파일의 제조업체에서 제공하는 지름에서 0.01-0.02 인치의 유사한 허용 오차가 차감되었습니다.
RPA 반응은 첫 번째 플루오리미터 구성을 사용하여 성공적으로 모니터링되었으며, RT-LAMP 반응은 두 구성을 사용하여 모니터링할 수 있었습니다. 첫 번째 구성의 개선된 길광 거부는 RPA 반응에서 형광 프로브에 의해 생성된 낮은 수준의 형광을 모니터링하는 데 필요했습니다. 반면 RT-LAMP는 신호 생성을 위해 상호 연관된 염료를 사용하여 사진 필터 호일을 사용하여 두 번째 구성의 낮은 동적 범위와 호환되는 형광 강도가 더 높습니다. 사용자는 형광 신호 발생 요소-연질 염료 또는 형광 프로브-분석의 일치하는 형광계 구성을 선택해야 합니다.
이 시스템의 한 가지 제한은 난방이 표준 벽 콘센트를 통해 구동되는 상용 열 블록에 의해 제공된다는 것입니다. 이 시스템은 다른그룹(12)에표시된 대로 휴대용 및 충전식 배터리 팩을 통합하여 전기에 대한 신뢰할 수 있는 액세스가 부족한 지역에서 사용하기 위해 더욱 개발될 수 있다. 또 다른 제한은 시스템의 상대적으로 낮은 처리량으로, 한 번에 두 개의 시료만 동시 형광 측정을 가능하게 합니다. 인클로저의 여러 인쇄는 처리량을 증가시키기 위해 동일한 열 블록 위에 배치 할 수 있습니다; 그러나 사용되는 광 센서에는 4개의 고유한 I2C 주소만 있습니다. 이렇게 하면 동시에 측정할 수 있는 최대 샘플 수를 4개로 제한합니다. 처리량을 더욱 늘리기 위해서는 고유한 I2C 주소가 더 많은 다른 광 센서가 필요합니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
첼시 스미스, 메건 장, 에밀리 뉴스햄, 사이 폴, 크리스토퍼 고에게 샘플 준비를 지원해 주신 특별한 감사를 드립니다. 저자는 원고 개정에 대한 캐롤라인 녹스슨 에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 자금은 IAVI와 USAID 사이의 수상 AID-OAA-A16-00032에 따라 IAVI 연구 보조금 CCID 9204를 통해 USAID에 의해 미국 국민으로부터 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED - 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
References
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