Summary

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Published: February 12, 2021
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Abstract

Het genereren van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit een enkele bloedafname heeft enorme belangstelling getrokken voor precisiegeneeskunde bij hart- en vaatziekten. Cardiale differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) wordt gemoduleerd door gedefinieerde signaalroutes die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling. Talrijke cardiale differentiatiemethoden op 2D- en 3D-platforms zijn ontwikkeld met verschillende efficiënties en cardiomyocytenopbrengst. Dit heeft onderzoekers buiten het veld verbaasd, omdat de verscheidenheid van deze methoden moeilijk te volgen kan zijn. Hier presenteren we een uitgebreid protocol dat robuuste generatie en uitbreiding van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) uitwerkt. We beschrijven eerst een zeer efficiënt iPSC-herprogrammeringsprotocol van het bloedmonster van een patiënt met behulp van niet-geïntegreerde Sendai-virusvectoren. Vervolgens beschrijven we een kleine molecuul-gemedieerde monolaagdifferentiatiemethode die robuust kloppende cardiomyocyten kan produceren uit de meeste menselijke iPSC-lijnen. Daarnaast wordt een schaalbaar cardiomyocytenuitbreidingsprotocol geïntroduceerd met behulp van een klein molecuul (CHIR99021) dat patiënt-afgeleide cardiomyocyten snel kan uitbreiden voor industriële en klinische toepassingen. Aan het einde worden gedetailleerde protocollen voor moleculaire identificatie en elektrofysiologische karakterisering van deze iPSC-CM’s weergegeven. We verwachten dat dit protocol pragmatisch is voor beginners met beperkte kennis over cardiovasculaire ontwikkeling en stamcelbiologie.

Introduction

De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen heeft een revolutie teweeggebracht in de moderne cardiovasculaire geneeskunde1,2. Menselijke iPSC’s zijn in staat om zichzelf te vernieuwen en alle celtypen in het hart te genereren, inclusief cardiomyocyten, endotheelcellen, gladde spiercellen en hartfibroblasten. Patiënt iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) kunnen dienen als onbepaalde bronnen voor het modelleren van genetisch overerfbare hart- en vaatziekten (CVD’s) en het testen van de cardiale veiligheid voor nieuwe geneesmiddelen3. In het bijzonder zijn patiënt iPSC-CMs goed voorbereid om genetische en moleculaire etiologieën van CVD’s te onderzoeken die zijn afgeleid van defecten in cardiomyocyten, zoals lang QT-syndroom4 en gedilateerde cardiomyopathie (DCM)5. In combinatie met CRISPR/ Cas9-gemedieerde genoombewerking hebben patiënt-iPSC-CM’s een ongekende weg geopend om de complexe genetische basis van CVD’s te begrijpen, waaronder aangeboren hartafwijkingen (CHD’s)6,7,8. Menselijke iPSC-CM’s hebben ook mogelijkheden getoond om te dienen als autologe celbronnen voor het aanvullen van het beschadigde myocard tijdens een hartaanval9. In de afgelopen jaren is het van het grootste belang geworden om hoogwaardige menselijke iPSC-CMs te genereren met gedefinieerde subtypen (atriale, ventriculaire en nodale) voor hartregeneratie en geneesmiddelentests10.

Cardiale differentiatie van menselijke iPSC’s is het afgelopen decennium sterk verbeterd. Differentiatiemethoden zijn gegaan van op embryoïde lichamen (EB) gebaseerde spontane differentiatie naar chemisch gedefinieerde en gerichte cardiale differentiatie11. Belangrijke signaalmoleculen die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling, zoals Wnt, BMP, Nodal en FGF, worden gemanipuleerd om de differentiatie van cardiomyocyten van menselijke iPSC’s10,12te verbeteren. Belangrijke vooruitgang omvat sequentiële modulatie van Wnt-signalering (activering gevolgd door remming) voor robuuste generatie van cardiomyocyten uit menselijke iPSC’s13,14. Chemisch gedefinieerde hartdifferentiatierecepten zijn onderzocht om grootschalige productie van kloppende cardiomyocyten15,16tevergemakkelijken, die het potentieel hebben om te worden opgewaardeerd tot productie op industrieel en klinisch niveau. Bovendien wordt een robuuste uitbreiding van vroege menselijke iPSC-CM’s bereikt door blootstelling aan constitutieve Wnt-activering met behulp van een kleine chemische stof (CHIR99021)17. Meest recent worden subtypespecifieke cardiomyocyten gegenereerd door manipulatie van retinoïnezuur (RA) en Wnt-signaalroutes bij specifieke differentiatievensters tijdens cardiomyocytenlijnverbintenis van menselijke iPSC’s18,19,20,21,22.

In dit protocol beschrijven we een werkprocedure voor robuuste generatie en proliferatie van menselijke CM’s afkomstig van perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten. We presenteren protocollen voor 1) het herprogrammeren van menselijke PBMC’s naar iPSC’s, 2) robuuste generatie van kloppende cardiomyocyten van menselijke iPSC’s, 3) snelle uitbreiding van vroege iPSC-CMs, 4) moleculaire karakterisering van menselijke iPSC-CMs, en 5) elektrofysiologische meting van menselijke iPSC-CMs op het niveau van eencellige door patchklem. Dit protocol omvat de gedetailleerde experimentele procedures voor het omzetten van bloedcellen van patiënten in kloppende cardiomyocyten.

Protocol

De experimentele protocollen en geïnformeerde toestemming voor menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) in het Nationwide Children’s Hospital. 1. Bereiding van celkweekmedia, oplossingen en reagentia PBMC-media voorbereiden Meng 20 ml basale PBMC-cultuurmedia (1x) en 0,52 ml supplement. Voeg elk 20 μL SCF en FLT3 toe (voorraadconcentratie: 100 μg/ml), 4 μL IL3, IL6 en EPO elk (voorraadconcentratie: 100 μg/ml) en 200 μL L-gluta…

Representative Results

Menselijke iPSC-herprogrammering van PBMC’sNa prekweek met Complete Blood Media gedurende 7 dagen worden PBMC’s groot met zichtbare kernen en cytoplasma(figuur 1B),wat aangeeft dat ze klaar zijn voor virustransfectie. Na transfectie met de sendai virus herprogrammeringsfactoren, zullen PBMC’s nog een week een epigenetisch herprogrammeringsproces ondergaan. Meestal krijgen we 30-50 iPSC-kolonies van de transfectie van 1 x 105 PB…

Discussion

Tijdens iPSC-herprogrammering is het van cruciaal belang om PBMC’s gedurende 1 week te kweken totdat ze zijn vergroot met duidelijke kernen en cytoplasma. Omdat PBMC’s zich niet vermenigvuldigen, is een geschikt celnummer voor virale transductie belangrijk voor een succesvolle iPSC-herprogrammering. Het celaantal PBMC’s, de multipliciteit van infectie (MOI) en de titer van het virus moeten worden overwogen en aangepast om de optimale transductieresultaten te bereiken. Voor cardiale differentiatie is de initiële zaaidich…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF en SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) subsidies 1R01HL124245, 1R01HL132520 en R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao werd ook ondersteund door start-upfondsen van het Abigail Wexner Research Institute in het Nationwide Children’s Hospital.

Materials

ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

View Video