Method Article

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

DOI:

10.3791/62206

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February 12th, 2021

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1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

In This Article

Summary

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Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

Abstract

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La generación de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de una sola extracción de sangre ha atraído un gran interés en la medicina de precisión sobre las enfermedades cardiovasculares. La diferenciación cardíaca de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) está modulada por vías de señalización definidas que son esenciales para el desarrollo del corazón embrionario. Se han desarrollado numerosos métodos de diferenciación cardíaca en plataformas 2-D y 3-D con diversas eficiencias y rendimiento de cardiomiocitos. Esto ha desconcertado a los investigadores fuera del campo, ya que la variedad de estos métodos puede ser difícil de seguir. Aquí presentamos un protocolo integral que elabora una generación y expansión robustas de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Primero describimos un protocolo de reprogramación iPSC de alta eficiencia a partir de la muestra de sangre de un paciente utilizando vectores del virus de Sendai no integrados. A continuación, detallamos un pequeño método de diferenciación monocapa mediado por moléculas que puede producir cardiomiocitos de latido robusto a partir de la mayoría de las líneas iPSC humanas. Además, se introduce un protocolo de expansión de cardiomiocitos escalable utilizando una molécula pequeña (CHIR99021) que podría expandir rápidamente los cardiomiocitos derivados del paciente para aplicaciones de grado industrial y clínico. Al final, se representan protocolos detallados para la identificación molecular y la caracterización electrofisiológica de estos iPSC-CM. Esperamos que este protocolo sea pragmático para principiantes con conocimientos limitados sobre desarrollo cardiovascular y biología de células madre.

Introduction

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El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas por humanos ha revolucionado la medicina cardiovascular moderna1,2. Las iPSC humanas son capaces de autorrenovarse y generar todos los tipos de células en el corazón, incluidos los cardiomiocitos, las células endoteliales, las células del músculo liso y los fibroblastos cardíacos. Los cardiomiocitos derivados de iPSC para pacientes (iPSC-CM) pueden servir como recursos indefinidos para modelar enfermedades cardiovasculares genéticamente hereditarias (ECV) y probar la seguridad cardíaca de nuevos medicamentos3. En particular,....

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Protocol

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Los protocolos experimentales y el consentimiento informado para sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en el Nationwide Children's Hospital.

1. Preparación de medios de cultivo celular, soluciones y reactivos

  1. Preparar medios PBMC
    1. Mezclar 20 ml de medios de cultivo PBMC basales (1x) y 0,52 ml de suplemento. Añadir 20 μL de SCF y FLT3 cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL), 4 μL de IL3, IL6 y EPO cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL) y 200 μL de L-glutamina alternativa (100x). Mézclalos bien. Filtrar en una campana estéril utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm. Nombra....

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Results

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Reprogramación de iPSC humanos desde PBMC
Después del precultivo con medios sanguíneos completos durante 7 días, los PBMC se vuelven grandes con núcleos y citoplasma visibles(Figura 1B),lo que indica que están listos para la transfección del virus. Después de la transfección con los factores de reprogramación del virus de Sendai, los PBMC se someterán a un proceso de reprogramación epigenética durante otra semana. Por lo general, obtenemos.......

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Discussion

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Durante la reprogramación de iPSC, es fundamental cultivar PBMC durante 1 semana hasta que se agranden con núcleos y citoplasma claros. Debido a que los PBMC no proliferan, un número de células apropiado para la transducción viral es importante para una reprogramación exitosa de iPSC. El número celular de PBMC, la multiplicidad de la infección (MOI) y el título del virus deben considerarse y ajustarse para alcanzar los resultados óptimos de transducción. Para la diferenciación cardíaca, la densidad de siembra inicial es .......

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Disclosures

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Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

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Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo Profesional 18CDA34110293 (M-T.Z.) de la American Heart Association (AHA), los premios AVIF y SVRF de La American Heart Association (M-T.Z.), las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 y R01HL096962 (I.D.). El Dr. Ming-Tao Zhao también recibió el apoyo de fondos iniciales del Instituto de Investigación Abigail Wexner en el Nationwide Children's Hospital.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ABI 7300 Sistema rápido de PCR en tiempo realThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Amplificador de microelectrodosMolecular DevicesAmplificador de microelectrodos
B27 suplementoThermo Fisher Scientific17504044
B27 sin insulinaThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Kit de fijación/permeabilizaciónBD Biosciences554714solución de fijación/permeabilización, tampón de permanente
BD Vacutainer Tubo CPTBD Biosciences362753Tubo de separación de células sanguíneas
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Kit de reprogramación SendaiThermo Fisher ScientificA16517Sendai
Digidata 1200BAxon InstrumentsPlaca de adquisición
Kit de minipreparación de ARN de zol directo Kit deextracción de ARNZymo ResearchR2050
DMEM/F12Medio Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8Medios Thermo Fisher ScientificA1517001E8 para cultivo de iPSC
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Alternativa a la L-glutamina
Reducción del factor de crecimiento MatrigelCorning356231Matriz de membrana basal
Kit de Snythesis de ADNc iScript SíntesisADNc1708891 Bio-Rad
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
Reemplazo de suero knockOut (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0Dispositivos moleculares Electrofisiologíasoftware de adquisición y análisis de datos
EPO humano recombinanteThermo Fisher ScientificPHC9631
FLT3 humano recombinanteThermo Fisher ScientificPHC9414
IL3 humano recombinantePeprotech200-03
IL6 humano recombinanteThermo Fisher Scientific
SCF humano recombinantePeprotech300-07
RPMI 1640 medioThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 medio, sin glucosaThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Mountant Antifade ThermoFisher ScientificS36936Medios de montaje
StemPro-34 SFMThermo Medioscultivo Fisher Scientific 10639011 PBMC
Mezcla maestra avanzada rápida TaqManThermo Fisher Scientific4444964mezcla maestra de qPCR
TrypLE Select Enzyme 10x, sin rojo fenolSolución de disociaciónThermo Fisher ScientificA1217703
UltraPure 0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020iPSC solución de disociación
Y-27632 2HClProductos químicos SelleckS1049
/lavado de PHC0065 de CM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318

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Cardiomyocyte GenerationPeripheral Blood MononucleariPSC ReprogrammingSendai Virus ReprogrammingCardiac DifferentiationMonolayer DifferentiationCardiomyocyte ExpansionPatch ClampTroponin T ExpressionWnt Activation

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