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Developmental Biology

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur robusten Erzeugung und Erweiterung menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patienteneigenen peripheren Blutes vor.

Abstract

Die Generierung patientenspezifischer Kardiomyozyten aus einer einzigen Blutentnahme hat ein enormes Interesse an der Präzisionsmedizin bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen geweckt. Die kardiale Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) wird durch definierte Signalwege moduliert, die für die embryonale Herzentwicklung essentiell sind. Zahlreiche kardiale Differenzierungsmethoden auf 2-D- und 3D-Plattformen wurden mit unterschiedlichen Wirkungsgraden und Kardiomyozytenausbeute entwickelt. Dies hat Ermittler außerhalb des Feldes verwirrt, da die Vielfalt dieser Methoden schwer zu verfolgen sein kann. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, das eine robuste Erzeugung und Erweiterung von patientenspezifischen Kardiomyozyten aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) ausarbeitet. Wir beschreiben zunächst ein hocheffizientes iPSC-Reprogrammierungsprotokoll aus der Blutprobe eines Patienten unter Verwendung von Sendai-Virusvektoren ohne Integration. Wir beschreiben dann eine kleinmolekülvermittelte Monolayer-Differenzierungsmethode, die aus den meisten menschlichen iPSC-Linien robust schlagende Kardiomyozyten herstellen kann. Darüber hinaus wird ein skalierbares Kardiomyozyten-Expansionsprotokoll unter Verwendung eines kleinen Moleküls (CHIR99021) eingeführt, das von Patienten abgeleitete Kardiomyozyten für industrielle und klinische Anwendungen schnell erweitern könnte. Am Ende werden detaillierte Protokolle zur molekularen Identifizierung und elektrophysiologischen Charakterisierung dieser iPSC-CMs dargestellt. Wir erwarten, dass dieses Protokoll für Anfänger mit begrenztem Wissen über kardiovaskuläre Entwicklung und Stammzellbiologie pragmatisch ist.

Introduction

Die Entdeckung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen hat die moderne kardiovaskuläre Medizin revolutioniert1,2. Menschliche iPS-Zellen sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und alle Zelltypen im Herzen zu erzeugen, einschließlich Kardiomyozyten, Endothelzellen, glatte Muskelzellen und kardiale Fibroblasten. Patienten-iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) können als unbestimmte Ressourcen für die Modellierung genetisch vererbbarer Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) und die Prüfung der kardialen Sicherheit für neue Medikamente dienen3. Insbesondere sind die iPSC-CMs der Patienten gut aufgestellt, um genetische und molekulare Ätiologien von CVDs zu untersuchen, die von Defekten in Kardiomyozyten wie dem long QT-Syndrom4 und der dilatativen Kardiomyopathie (DCM)5abgeleitet sind. In Kombination mit DER CRISPR/Cas9-vermittelten Genom-Editierung haben patienteneigene iPSC-CMs einen beispiellosen Weg eröffnet, um die komplexe genetische Basis von CVDs einschließlich angeborener Herzfehler (KHK) zu verstehen6,7,8. Menschliche iPSC-CMs haben auch das Potenzial gezeigt, als autologe Zellquellen für die Auffüllung des beschädigten Myokards während eines Herzinfarkts zu dienen9. In den letzten Jahren ist es von größter Bedeutung, qualitativ hochwertige humane iPSC-CMs mit definierten Subtypen (Atrial, Ventrikel und Knoten) für die Herzregeneration und Drogentests zu generieren10.

Die kardiale Differenzierung von humanen iPS-Zellen wurde in den letzten zehn Jahren stark vorangetrieben. Differenzierungsmethoden sind von der embryoiden Körper (EB)-basierten spontanen Differenzierung zur chemisch definierten und gerichteten Herzdifferenzierung übergegangen11. Wichtige Signalmoleküle, die für die embryonale Herzentwicklung unerlässlich sind, wie Wnt, BMP, Nodal und FGF, werden manipuliert, um die Differenzierung von Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen zu verbessern10,12. Zu den signifikanten Fortschritten gehören die sequentielle Modulation der Wnt-Signalgebung (Aktivierung gefolgt von Inhibition) für eine robuste Erzeugung von Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen13,14. Chemisch definierte kardiale Differenzierungsrezepte wurden untersucht, um die großtechnische Produktion von schlagenden Kardiomyozyten15,16zuerleichtern,die das Potenzial haben, auf industrielle und klinische Ebene aufgerüstet zu werden. Darüber hinaus wird eine robuste Expansion von frühen humanen iPSC-CMs durch die Exposition gegenüber konstitutiver Wnt-Aktivierung unter Verwendung einer kleinen Chemikalie (CHIR99021)17erreicht. In jüngster Zeit werden subtypspezifische Kardiomyozyten durch Manipulation von Retinsäure (RA) und Wnt-Signalwegen an spezifischen Differenzierungsfenstern während der Kardiomyozyten-Linienverpflichtung von menschlichen iPS-Zellenerzeugt 18,19,20,21,22.

In diesem Protokoll beschreiben wir ein Arbeitsverfahren für die robuste Erzeugung und Proliferation menschlicher CMs, die aus mononukleären Zellen des patienten peripheren Blutes stammen. Wir präsentieren Protokolle für 1) die Reprogrammierung menschlicher PBMCs in iPS-Zellen, 2) die robuste Erzeugung von schlagenden Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen, 3) die schnelle Expansion früher iPSC-CMs, 4) die molekulare Charakterisierung menschlicher iPSC-CMs und 5) die elektrophysiologische Messung menschlicher iPSC-CMs auf Einzelzellebene per Patch clamp. Dieses Protokoll deckt die detaillierten experimentellen Verfahren zur Umwandlung von Patientenblutzellen in schlagende Kardiomyozyten ab.

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Protocol

Die experimentellen Protokolle und die Einverständniserklärung für menschliche Probanden wurden vom Institutional Review Board (IRB) des Nationwide Children's Hospital genehmigt.

1. Herstellung von Zellkulturmedien, Lösungen und Reagenzien

  1. Vorbereiten von PBMC-Medien
    1. Mischen Sie 20 ml basale PBMC-Kulturmedien (1x) und 0,52 ml Nahrungsergänzungsmittel. Fügen Sie jeweils 20 μL SCF und FLT3 (Stammkonzentration: 100 μg/ml), je 4 μL IL3, IL6 und EPO (Stammkonzentration: 100 μg/ml) und 200 μL L-Glutamin-Alternative (100x) hinzu. Mischen Sie sie gründlich. Filtern Sie in einer sterilen Haube mit einer 0,22-μm-Filtereinheit. Nennen Sie dies als Complete Blood Media.
    2. Mischen Sie 20 ml basale PBMC-Kulturmedien (1x) und 0,52 ml des Supplements. Fügen Sie 200 μL L-Glutamin-Alternative (100x) hinzu. Mischen Sie sie gründlich. Filtern Sie mit einer 0,22-μm-Filtereinheit. Nennen Sie dies als Supplement Blood Media.
  2. Vorbereiten kompletter E8-Medien
    1. Mischen Sie 500 ml E8-Basalmedien und 10 ml E8-Präparat (über Nacht bei 4 ° C aufgetaut), um vollständige E8-Medien herzustellen. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
  3. Vorbereiten von iPSC-Passaging-Medien
    1. 40 μL Y-27632 Gesteinsinhibitor (1:5.000 Verdünnung, Stammkonzentration: 10 mM) zu 200 ml vollständigem E8-Medium geben. Mischen Sie es gründlich. Vor Gebrauch auf RT ausbalancieren.
  4. Kardiomyozyten-Differenzierungsmedien vorbereiten
    1. Medium I: Mischen Sie 500 ml RPMI1640 mit 10 ml B27 abzüglich Insulinergänzung (50x).
    2. Medium II: Fügen Sie ein geeignetes Volumen der CHIR99021 (GSK3-Inhibitor) Brühe zu Medium I (CHIR99021 Endkonzentration von 6 μM) hinzu. Gründlich mischen.
    3. Medium III: Zu Medium I (IWR-1 Endkonzentration von 5 μM) wird ein geeignetes Volumen IWR-1 (Wnt-Inhibitor) gegeben. Gründlich mischen.
    4. Medium IV: Mischen Sie 500 ml RPMI1640 mit 10 ml B27-Ergänzung (50x). Gründlich mischen.
    5. Medium V: Mischen Sie 500 ml RPMI1640 (keine Glukose) mit 10 ml B27-Präparat (50x). Gründlich mischen.
    6. Medium VI: Fügen Sie ein entsprechendes Volumen der CHIR99021-Brühe zu Medium IV hinzu (CHIR99021-Endkonzentration von 2 μM). Gründlich mischen.
  5. Vorbereiten von iPSC-CM-Passaging-Medien
    1. Fügen Sie 10 ml Knockout Serum Replacement (KSR) zu 90 mL Media IV hinzu (KSR-Endkonzentration: 10%). Gut mischen.
  6. Vorbereiten von iPSC-CM-Gefriermedien
    1. 1 ml DMSO auf 9 ml KSR (Endkonzentrationen: 10 % DMSO/90 % KSR) geben und gut mischen.
  7. Bereiten Sie mittelbeschichtete Platten für die Basalmembranmatrix vor
    1. Auftauen des Basalmembranmatrixmediums bei 4 °C über Nacht und aliquot in 1,5 ml Röhrchen. 1 mL dieses Mediums zu 250 mL DMEM/F12-Medien (1:250 Verdünnung) geben und gründlich mischen. 2 ml der verdünnten Lösung pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte auftragen und vor Gebrauch 30 min lang in 5 %CO2 bei 37 °C inkubieren.

2. iPSC-Neuprogrammierung von PBMCs

  1. Trennen Sie PBMCs von Blutproben.
    1. Sammeln Sie Patientenblutproben (~ 5 ml) und übertragen Sie sie in Blutzelltrennröhrchen (siehe Materialtabelle). Mischen Sie, indem Sie 10x invertieren.
    2. Zentrifuge bei 1.500 x g für 30 min bei Raumtemperatur.
    3. Die Röhrchen vorsichtig herausnehmen und mit 70% Ethanol besprühen. Entfernen Sie unter einer Biosicherheitshaube die Kappen, ohne die mononukleären Zellen (Buffy-Schicht) zu stören. PBMCs befinden sich in einer weißlichen Schicht direkt unter der Plasmaschicht (Abbildung 1A). Sammeln Sie die gesamte Buffy-Schicht mit einer 1000 μL Pipette und geben Sie sie in ein 15 mL konisches Rohr.
    4. Zählen Sie die Zellnummer mithilfe eines automatisierten Zellzählers. Drehen Sie die Röhre bei 300 x g für 25 min bei RT.
    5. Verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie mit 10 ml DPBS (Ca2+/ Mg2+ frei).
    6. Drehen Sie die Röhre bei 300 x g für 15 min bei RT.
    7. Entfernen Sie den Überstand. Resuspend Zellpellets in 1 ml des Gefriermediums (KSR plus 10% DMSO). Passen Sie die Zelldichte an, um 1 x 106 Zellen pro Durchstechflasche zu erhalten.
    8. PBMC-Kryovolen in einen Zellgefrierbehälter geben und über Nacht bei -80 °C aufbewahren. Am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank geben.
  2. iPSC-Neuprogrammierung.
    1. Fügen Sie 3 ml Supplement Blood Media in ein 15 ml konisches Röhrchen hinzu. PBMCs im 37 °C Wasserbad auftauen und in ein konisches Rohr geben. Drehen Sie bei 300 x g für 7 min bei RT.
    2. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspend PBMCs mit vollständigen Blutmedien. Säen Sie sie in zwei Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte (keine Basalmembranmatrix).
    3. 5%CO2 bei 37 °C über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag entfernen Sie vorsichtig die Hälfte der alten Medien (0,5 ml) und fügen Sie 0,5 ml frische Complete Blood Media hinzu.
    4. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, indem Sie die Hälfte der alten Medien aktualisieren.
    5. Nach einer Woche waschen Sie den Brunnen aggressiv mit 1 ml Supplement Blood Media und übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
    6. Zählen Sie die Zellennummer. Nehmen Sie 2 x 105 Zellen und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 7 min.
    7. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen mit 300 μL vollständigen Blutmedien. Führen Sie eine Transfektion durch, indem Sie ein geeignetes Volumen an Sendai-Virus-Reprogrammierungsvektoren gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzufügen. Übertragen Sie sie in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte (keine Basalmembranmatrix). 5%CO2 bei 37 °C über Nacht inkubieren.
    8. Am nächsten Tag bei 300 x g für 7 min drehen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 2 ml Complete Blood Media. In eine Vertiefung einer mit Kellermembranmatrix vorbeschichteten 6-Well-Platte überführen. Dies ist Tag 1 (D1).
    9. Berühren Sie den Teller nicht am nächsten Tag.
    10. Entfernen Sie auf D3 1 ml des alten Mediums. Fügen Sie 1 ml Supplement Blood Media hinzu.
    11. Wiederholen Sie Schritt 2.2.10 auf D5.
    12. Entfernen Sie auf D7 1 ml des alten Mediums. Fügen Sie 1 ml komplette E8-Medien hinzu.
    13. Wiederholen Sie auf D8 Schritt 2.2.12.
    14. Entfernen Sie auf D9 die alten Medien. Fügen Sie 2 ml komplette E8-Medien hinzu. Von vollständig reprogrammierten Zellen wird erwartet, dass sie sich anheften und beginnen, Kolonien zu bilden.
    15. Aktualisieren Sie täglich mit 2 ml kompletten E8-Medien.
    16. Etwa 2 Wochen nach der Übertragung des Sendai-Virus erscheinen große iPSC-Kolonien und sind bereit für die Ernte.
    17. Schneiden Sie iPSC-Kolonien unter ein Stereomikroskop in der Haube und übertragen Sie die einzelnen Kolonien auf eine mit einer Basalmembranmatrix beschichtete 24-Well-Platte, die mit 0,5 ml iPSC-Passaging-Medien vorgeladen ist.
    18. Täglich mit 0,5 ml komplettem E8-Medium erfrischen, bis die iPSC-Kolonien groß genug werden, um in eine neue, mit Basalmembran-Matrix beschichtete 6-Well-Platte überzugehen.

3. Wartung und Weitergabe menschlicher iPSC

  1. Wenn menschliche iPS-Zellen eine Konfluenz von über 90% erreichen, entfernen Sie alte Medien. Einmal mit 3 ml DPBS abspülen.
  2. Fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA in DPBS-Lösung hinzu. 5%CO2 bei 37 °C für 5-8 min inkubieren.
  3. Entfernen Sie EDTA durch Aspiration. Fügen Sie 1 ml iPSC-Passaging-Medien hinzu. Entfernen Sie iPSCs manuell.
  4. Nehmen Sie 600-900 μL Einzelzellsuspension und schichten Sie sie auf eine matrixbeschichtete 6-Well-Platte der Kellermembran auf (Verdünnung: 1:6 bis 1:10). 5%CO2 bei 37 °C über Nacht inkubieren.
  5. Aktualisieren Sie täglich mit 2 ml kompletten E8-Medien. Die iPSC-Kulturen erreichen in der Regel nach 3-4 Tagen eine Konfluenz.

4. Chemisch definierte Kardiomyozytendifferenzierung

  1. Kultivieren Sie menschliche iPS-Zellen in vollständigen E8-Medien bis zu 95% konfluent (3-4 Tage).
  2. Entfernen Sie die alten Medien. Fügen Sie 2 ml CM-Differenzierungsmedium II (6 μM CHIR in RPMI1640 plus B27 minus Insulinergänzung) zu jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu. Dies ist D0. Berühren Sie D1 nicht.
  3. Auf D2 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium I (RPMI1640 plus B27 minus Insulinergänzung) ersetzen.
  4. Auf D3 durch 2 ml CM Differenzierung Media III (5 μM IWR-1 in RPMI1640 plus B27 minus Insulinergänzung) ersetzen. Berühren Sie D4 nicht.
  5. Ersetzen Sie auf D5 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium I.
  6. Ersetzen Sie auf D7 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium IV (RPMI1640 plus B27-Ergänzung). Danach aktualisieren Sie die Medien jeden zweiten Tag.
  7. Auf D11, wenn kontrahierende Zellen beobachtet werden, ersetzen Sie durch 2 ml CM-Differenzierung Media V (keine Glukose).
  8. Ersetzen Sie auf D13 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium V.
  9. Ersetzen Sie bei D15 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium IV.
  10. Ersetzen Sie bei D17-D21 jeden zweiten Tag durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium IV.

5. Passage menschliche iPSC-CMs

  1. Entfernen Sie alte Medien und spülen Sie die Zellen einmal mit 3 ml DPBS aus.
  2. Tragen Sie 1 ml CM-Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle)auf jede Vertiefung einer 6-Well-Platte auf. 5%CO2 bei 37 °C für 5-8 min inkubieren.
  3. Mechanisch dissoziieren Sie iPSC-CMs durch kräftiges Pipettieren in einzelne Zellen.
  4. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Rohr. Fügen Sie 2 ml CM-Passaging-Medien (10% KSR in RMPI1640 plus B27-Ergänzung) hinzu, um die CM-Dissoziationslösung zu neutralisieren.
  5. Drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei RT.
  6. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen mit einem gewünschten Volumen an CM-Passageing-Medien. Säen Sie sie in eine mit Basalmembranmatrix beschichtete Platte / Schüssel. Menschliche iPSC-CMs schlagen 1-3 Tage nach dem Passieren wieder.

6. Ausbau menschlicher iPSC-CMs

  1. Spülen Sie D10-12 schlagende iPSC-CMs mit 3 ml DPBS für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte einmal ab. Fügen Sie 1 ml CM-Dissoziationslösung hinzu (Schritt 5.2). Inkubieren sie in 5%CO2 bei 37 °C für 7-10 min.
  2. Mechanisch dissoziieren Sie iPSC-CMs durch kräftiges Pipettieren in einzelne Zellen.
  3. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Rohr. Fügen Sie 2 ml CM-Überlaufmedien hinzu, um die CM-Dissoziationslösung zu neutralisieren.
  4. Drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei RT.
  5. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen mit einem geeigneten Volumen an CM-Passaging-Medien. Pipetten Sie auf und ab, um eine Einzelzellensuspension herzustellen. Säen Sie eine Million iPSC-CMs in eine mit Basalmembranmatrix beschichtete 10-cm-Schüssel.
  6. Am nächsten Tag alte Medien entfernen. Fügen Sie 10 ml Kardiomyozyten-Proliferationsmedien hinzu (Media VI: 2 μM CHIR99021). Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag.
  7. Wenn iPSC-CMs nach 7-9 Tagen Kultur zusammenfließen, wiederholen Sie den Passaging-Schritt für den weiteren Ausbau von iPSC-CMs.

7. Immunfluoreszenz

  1. Vor der Immunfluoreszenzfärbung werden iPSC-CMs auf mit Basalmembranmatrix beschichtete Deckgläser gesät, die in eine 24-Well-Platte (Aussaatdichte: 0,5-1 x 106 Zellen/ml) eingebracht werden. Pflegen Sie iPSC-CMs mindestens 4 Tage lang in Kultur.
  2. Zellen einmal mit 1 ml DPBS waschen.
  3. 0,5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) zugeben und 15 min bei RT inkubieren.
  4. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml DPBS. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.
  5. 0,5 ml 0,1% Triton X-100 zugeben und 20 min bei RT inkubieren.
  6. Zweimal mit 1 ml DPBS waschen.
  7. Fügen Sie 0,5 ml 0,2% BSA in DPBS (Blockierlösung) hinzu. Inkubieren Sie bei RT für 1 h.
  8. Fügen Sie 200 μL primären Antikörper hinzu, der mit Blockierlösung verdünnt ist (Verdünnung: 1:400-1:1000). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  9. Zellen mit 0,5 ml Blocklösung für 3 min mit Schütteln waschen. Wiederholen Sie dies zweimal.
  10. Fügen Sie 200 μL sekundären Antikörper hinzu, der in der Blockierungslösung verdünnt ist. Inkubieren Sie bei RT für 1 h.
  11. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 0,5 ml DPBS, jeweils für 3 min unter Schütteln.
  12. Enthaltekerne mit DAPI (1:2000 Verdünnung) und inkubieren sie für 5 min bei RT.
  13. Spülen Sie die Zellen dreimal mit 0,5 ml DPBS.
  14. Montieren Sie Zellen auf den Deckgläsern auf einem Objektträger mit 5 μl Montagemedien. Bei 4 °C lagern und vor Licht schützen.

8. Durchflusszytometrie Probenvorbereitung

  1. Menschliche iPSC-CMs einmal mit 3 ml DPBS waschen.
  2. 1 mL CM-Dissoziationslösung zugeben und 5%CO2 bei 37 °C für 7-10 min inkubieren.
  3. Entfernen Sie Zellen mit einer 1.000-μL-Pipette. Die Zellsuspension wird durch eine Siebkappe in ein rundes FACS-Rohr übertragen. Das FACS-Röhrchen ist mit 1 ml iPSC-CM-Passagiermedium (10% KSR) vorgefüllt, um die Enzymaktivität zu neutralisieren.
  4. Bei 300 x g für 5 min drehen.
  5. Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie 250 μL Fixations-/Permeabilisierungslösung hinzu (siehe Tabelle der Materialien). 20 min bei 4 °C inkubieren.
  6. Fügen Sie 1 ml Dauerwelle / Waschpuffer hinzu. Kurz wirbeln und 4 min mit 300 x g drehen.
  7. Verwerfen Sie den Überstand. 100 μL verdünnte Primärantikörper (1:200-1:500) in 1x Perm/Wash-Puffer geben. Kurz wirbeln und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  8. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Dauerwelle / Waschpuffer. Kurz wirbeln und 4 min mit 300 x g drehen.
  9. Verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 100 μL verdünnte sekundäre Antikörper (1:500-1:1.000) hinzu. Kurz wirbeln und bei RT 1 h inkubieren. Vor Licht schützen, wenn sekundäre Antikörper mit lichtempfindlicher Fluoreszenz konjugiert werden.
  10. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Dauerwelle / Waschpuffer. Kurz wirbeln und 4 min bei 300g drehen.
  11. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen mit 400 μL FACS-Färbepuffer (PBS/4% FBS). Bei 4 °C lagern bis zum Laden auf ein FACS-Gerät.

9. Echtzeit-qPCR

  1. Entfernen Sie alte Medien in der menschlichen iPSC-CM-Kultur. Fügen Sie 500-700 μL Lysepuffer hinzu, um Zellen zu lysatieren. Scape-Zelllysat 3 min inkubieren und in ein 1,5-ml-RNase-freies Röhrchen geben. Fahren Sie sofort mit der Gesamt-RNA-Extraktion fort oder lagern Sie sie bei -80 °C.
  2. Isolieren Sie die Gesamt-RNA mit einem RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Messen Sie die RNA-Konzentration und beurteilen Sie die Qualität der Gesamt-RNA mit einem Spektralphotometer.
  4. Führen Sie eine umgekehrte Transkriptionsreaktion mit einem cDNA-Synthesekit durch. Das Gesamtvolumen der RT-Reaktion beträgt 20 μL einschließlich 4 μL Reaktionsmischung (5x), 1 μL Reverse Transkriptase, 1 μg Gesamt-RNA und RNase-freiem Wasser.
  5. Inkubieren Sie das komplette RT-Reaktionsgemisch in einem Thermocycler nach folgendem Protokoll: 25 °C für 5 min; 46 °C für 20 min; 95 °C für 1 min; bei 4 °C halten.
  6. cDNA mit nukleasefreiem Wasser um 1:10 verdünnen. Richten Sie eine Echtzeit-qPCR-Reaktion ein, indem Sie 1 μL cDNA-Template, 1 μL Primer/Sonde, 10 μL qPCR-Master-Mix und 8 μL nukleasefreies Wasser mischen.
  7. Ausführung in einem Real-Time-PCR-System. Das Zyklusprotokoll beträgt 50 °C 2 min (Hold), 95 °C 10 min (Hold), 95 °C 15 Sec, 60 °C 1 min, Wiederholung für 40 Zyklen.
  8. Sammeln Sie CT-Werte für jedes Gen in jeder Probe. Die relative mRNA-Häufigkeit wird berechnet, indem derC-T-Wert des Zielgens vomC-T-Wert eines Housekeeping-Gens subtrahiert wird. Die relative Genexpression wird mit der2-ΔΔCT-Methode analysiert.

10. Aufzeichnung der Patch-Clamp-Klemme für die ganze Zelle

  1. Dissoziieren Sie iPSC-CMs in einzelne Zellen unter Verwendung der CM-Dissoziationslösung, wie zuvor beschrieben.
  2. Samenzellen mit geringer Dichte auf mit Basalmembranen beschichteten Deckgläsern. Kulturieren Sie sie für 3-4 Tage in Media IV.
  3. Ziehen Sie Pipetten (Widerstand 0,9-1,5 MΩ) aus Borosilikatglaskapillaren mit einem horizontalen Mikroelektrodenzieher.
  4. Inkubieren sie Zellen in Tyrodes Lösung (pH=7,35).
  5. Füllen Sie Pipetten mit Elektrodenlösung (pH=7,3), die aus folgenden Chemikalien besteht: 120 mM Asparaginsäure, 20 mM KCl, 2 mMMgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM Phosphokreatin, 4 mM K-ATP und 2mM Kreatinphosphokinase.
  6. Platzieren Sie die Zellen im Stromzangemodus mit einem diastolischen Schwellenwert von 1,5-2 und einem Stromimpuls von 5 ms bei 1 Hz.
  7. Erfassen Sie Aktionspotentiale (APs) mit einem Mikroelektrodenverstärker und einer softwaregesteuerten Erfassungskarte.

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Representative Results

Menschliche iPSC-Reprogrammierung von PBMCs
Nach der Vorkultur mit vollständigen Blutmedien für 7 Tage werden PBMCs groß mit sichtbaren Kernen und Zytoplasma (Abbildung 1B), was darauf hinweist, dass sie für die Virustransfektion bereit sind. Nach der Transfektion mit den Sendai-Virus-Reprogrammierungsfaktoren werden PBMCs für eine weitere Woche einem epigenetischen Reprogrammierungsprozess unterzogen. Typischerweise erhalten wir 30-50 iPSC-Kolonien aus der Transfektion von 1 x 105 PBMCs und die Reprogrammierungseffizienz beträgt 0,03% -0,05%. Vollständig reprogrammierte Zellen heften sich an und beginnen Kolonien zu bilden, wenn sie in das gesamte E8-Medium eingeführt werden (Abbildung 1C). Diese frühen iPSC-Kolonien werden für weitere 7 Tage expandiert und dann mechanisch geschnitten und einzeln aufgenommen. Jede iPSC-Kolonie wird in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte überführt, um einzelne iPSC-Linien zu etablieren. Nach 4-5 Passagen werden iPSC-Kolonien rein mit sehr wenigen differenzierten Zellen (Abbildung 1D). In diesem Stadium sind die meisten Zellen in iPSC-Kolonien OCT4- und NANOG-positiv (Abbildung 1E), was ihre Pluripotenz zeigt. Stabile iPSC-Linien werden durch die fünfte Passage hergestellt.

Kardiale Differenzierung
Das kardiale Differenzierungsprotokoll ist in Abbildung 1Fdargestellt. Die kardiale Differenzierung wird eingeleitet, wenn iPS-Zellen für mindestens 10 Passagen aufrechterhalten werden. Der Grad der iPSC-Konfluenz ist kritisch, wenn CHIR99021 angewendet wird. Die Zelldichte beträgt mehr als 90% konfluent, aber nicht über konfluent. Wenn iPSC-Kolonien zu voll werden, beginnen sie eine spontane Differenzierung, die sich negativ auf die gerichtete Kardiomyozyten-Differenzierungseffizienz auswirkt. Schlagende Kardiomyozyten werden normalerweise nach Tag 12 der Differenzierung beobachtet (Video 1). Das Datum, an dem der Beginn des Schlagens auftritt, variiert und hängt von den verwendeten iPSC-Linien ab. Nach Glukosemangel und Replating zeigen iPSC-CMs spontane Schläge (Video 2) und eine ausgerichtete Sarkomerstruktur mit interkaliertem kardialem Troponin T (TNNT2) und α-Actinin (Abbildung 1G-H). Darüber hinaus ist die Reinheit von iPSC-CMs hoch, wobei mehr als 93% der Zellen TNNT2+ sind, wie die FACS-Analyse zeigt (Abbildung 1I).

Obwohl iPSC-CMs im Vergleich zu adulten Kardiomyozyten relativ unreif sind, zeigen sie ventrikuläre und atrialähnliche Aktionspotentiale, die mittels Ganzzell-Patch-Clamp gemessen werden (Abbildung 2A, B). In einer typischen kardialen Differenzierung sind Tag 30 iPSC-CMs eine Mischung aus ventrikulären, atrialen und knotenartigen Subtypen, wobei ventrikuläre CMs die Mehrheit ausmachen (60%, Abbildung 2C) unter Verwendung des oben genannten Differenzierungsprotokolls (Abbildung 1F). Unterschiedliche Differenzierungsprotokolle ergeben unterschiedliche Prozentsätze von Kardiomyozyten-Subtypen aufgrund unterschiedlicher Signalwegaktivierungen während der Zelllinienbestimmung10. Ventrikuläre CMs sind mit MYL2 gekennzeichnet (MLC2v, Abbildung 2D), während atriale iPSC-CMs mit NR2F2 gekennzeichnet sind (COUP-TFII, Abbildung 2E). Diese Marker werden in reiferen iPSC-CMs (>D30) und nicht in denen im Frühstadium stark exprimiert.

Erweiterung der iPSC-CMs durch Wnt-Aktivierung
Bei Säugetieren teilen sich erwachsene Kardiomyozyten nicht aktiv zur Selbsterneuerung. Dieses Phänomen tritt auch bei menschlichen iPSC-CMs auf. Einmal über D30 hinaus gereift, ist die Zellteilung von iPSC-CMs ein seltenes Ereignis, wodurch ihre Fähigkeit zur klinischen und industriellen Massenproduktion eingeschränkt wird. Um die Entwicklungsumgebung während der embryonalen Kardiomyozytenproliferation nachzuahmen, aktivieren wir den Wnt-Signalweg von CHIR99021, um die Vermehrung früher iPSC-CMs zu stimulieren. D12-14 iPSC-CMs (nach Aufreinigung durch Glukoseentzug) werden mit einer niedrigen Dichte in Gegenwart von 2 μM CHIR99021 ausgesät. Die Wnt-Aktivierung stimuliert die Zellteilung von iPSC-CMs und fördert die Expression von Zellzyklusregulatoren wie Cyclin D1 (Abbildung 3A), die den Zellzyklus dazu bringen können, durch die G1-Phase vorzudringen. Interessanterweise ermöglicht CHIR99021 eine robuste Proliferation von frühen iPSC-CMs für 2 Passagen im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 3B). Die Proliferationsfähigkeit von iPSC-CMs nimmt jedoch mit extensiver Passage ab (Abbildung 3B), was mit der begrenzten und gut kontrollierten Herzproliferation während der embryonalen Herzentwicklung übereinstimmt. Darüber hinaus scheint es nicht, dass CHIR99021 in der Lage ist, die Expansion reiferer iPSC-CMs zu stimulieren, wenn sie mehr als 30 Tage Differenzierung erreichen und stabile Sarkomerstrukturen entwickeln.

Figure 1
Abbildung 1: Humane iPSC-Reprogrammierung und Kardiomyozytendifferenzierung. (A) Ein schematisches Diagramm, das die PBMC-Schicht nach der Trennung von Patientenblutproben zeigt. (B) Vergrößerte PBMCs sind bereit für die Transfektion. (C) Frühe menschliche iPSC-Kolonien. ( D) Eine eingerichtete iPSC-Linie an Durchgang 5. (E) Humane iPS-Zellen sind positiv für die Pluripotenzmarker OCT4 (grün) und NANOG (rot). Kerne werden durch DAPI (blau) gegengefärbt. (F) Überblick über ein Kardiomyozyten-Differenzierungsprotokoll. (G-H) Die Sarkomere-Struktur von iPSC-CMs wird durch Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen TNNT2 (grün) und α-Actinin (rot) aufgedeckt. Kerne werden durch DAPI (blau) gegengefärbt. (I) FACS-Analyse von iPSC-CMs unter Verwendung eines Antikörpers gegen TNNT2. Maßstabsleisten: 200 μm (B-D), 50 μm (E und G) und 20 μm (H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Kardiomyozyten-Subtypen in menschlichen iPSC-CMs. (A-B) Repräsentative Wirkungsdauern für ventrikuläre (A) und atrialähnliche (B) iPSC-CMs. (C) Repräsentative Prozentsätze ventrikulärer, atrialer und knotenartiger Subtypen in menschlichen iPSC-CMs. (D-E) D30 iPSC-CMs werden mit Antikörpern gegen den ventrikulären Kardiomyozytenmarker MYL2 (D) und den Atrialmarker NR2F2 (E) gefärbt. Zellen werden gleichzeitig mit einem TNNT2-Antikörper gefärbt. Kerne werden durch DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstabsleisten: 50 μm (D-E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Expansion humaner iPSC-CMs durch Wnt-Aktivierung. (A) Der Prozentsatz der Cyclin D1-positiven iPSC-CMs ist in Gegenwart von CHIR99021 erhöht. Die Zellen werden doppelt mit Antikörpern gegen TNNT2 (rot) und Cyclin D1 (grün) angefärbt. Kerne werden durch DAPI (blau) gegengefärbt. (B) Zellzahl faltet sich während der Expansion von menschlichen iPSC-CMs mit oder ohne CHIR99021 in den ersten 3 Passagen. Die Y-Achse zeigt die Änderungen der Zellzahlfaltung an. CHIR99021 stimuliert die robuste Proliferation von frühen iPSC-CMs. Maßstabsbalken: 50 μm(A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1. Menschliche iPSC-CMs am Tag 18 der Differenzierung schlagen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2. Schlagen von menschlichen iPSC-CMs am Tag 25 nach der metabolischen Reinigung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

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Discussion

Während der iPSC-Reprogrammierung ist es entscheidend, PBMCs für 1 Woche zu kultivieren, bis sie mit klaren Kernen und Zytoplasma vergrößert werden. Da sich PBMCs nicht vermehren, ist eine geeignete Zellzahl für die virale Transduktion wichtig für eine erfolgreiche iPSC-Reprogrammierung. Die Zellzahl der PBMCs, die Vielzahl der Infektionen (MOI) und der Titer des Virus sollten berücksichtigt und angepasst werden, um die optimalen Transduktionsergebnisse zu erreichen. Für die kardiale Differenzierung ist die anfängliche Seeding-Dichte entscheidend, damit iPS-Zellen am Tag der Verabreichung von CHIR99021 über 90% konfluent erreichen. Auf der einen Seite, wenn iPS-Zellen zum Zeitpunkt der kardialen Differenzierung weniger konfluent sind, ist CHIR99021 toxisch und führt zu einem erheblichen Zelltod. Auf der anderen Seite, wenn iPS-Zellen zu konfluent sind, werden sie einer spontanen Differenzierung unterzogen, die die Effizienz der gerichteten kardialen Differenzierung beeinträchtigt. Für die Erweiterung von frühen iPSC-CMs sollten das Timing und die Kardiomyozytenqualität berücksichtigt werden. Frühe iPSC-CMs können sich nur dann robust vermehren, wenn die Reinheit der Kardiomyozyten hoch genug ist. Vorhandene Nicht-Kardiomyozyten in der Kultur können sich auch als Reaktion auf die ChiR99021-Behandlung vermehren, was sich negativ auf die Proliferation früher iPSC-CMs auswirkt. Darüber hinaus ist es wichtig, die Kardiomyozytenexpansion bis zum 20. Tag der Differenzierung zu stimulieren. Sobald iPSC-CMs Tag 30 überschritten haben, wird es für sie schwierig sein, die robuste Aufteilung wieder aufzunehmen.

Humane iPS-Zellen wurden ursprünglich aus dermalen und Lungenfibroblasten über retrovirusvermittelte Transfektion1,2abgeleitet. Es gibt zwei Hauptprobleme bei diesen Reprogrammierungsmethoden, die den Fortschritt in der klinischen Translation von iPS-Zellen von Patienten verhindern: 1) Das Retrovirus integriert sich in das Wirtsgenom und führt so potenzielle genetische Mutationen ein; 2) Patienten-abgeleitete Fibroblasten erfordern Hautbiopsien, die viele Patienten ablehnen können. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Protokoll, das kommerzielle Nicht-Integration Sendai Virus23 und PBMCs verwendet, um Patienten-iPSCs robust abzuleiten. Diese iPS-Zellen sind frei von exogenen Reprogrammierungsvektoren und können mit Selbsterneuerung und Pluripotenz unbegrenzt aufrechterhalten werden. Darüber hinaus können Patientenblutproben leicht in klinischen Labors gesammelt werden. Unser Protokoll ist vielseitig und kann für die Massenproduktion von patienten- und krankheitsspezifischen iPS-Zellen für große Repositorys und klinische Übersetzungen verwendet werden24.

Eine robuste Kardiomyozytendifferenzierung wird durch sequentielle Modulation spezifischer Signalwege während der kardialen Differenzierung von menschlichen iPS-Zellen erreicht. Zu den wichtigsten Signalwegen, die an der kardialen Spezifikation und Proliferation beteiligt sind, gehören Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF und Retinsäure (RA) 10,12. Hier stellen wir ein effizientes kardiales Differenzierungsprotokoll durch sequentielle Modulation der Wnt-Signalgebung durch kleine Chemikalien vor: zuerst Aktivierung durch CHIR99021 und dann Hemmung durch IWR-113,14. Kleine Chemikalien sind stabil und liefern konsistente Differenzierungsergebnisse im Vergleich zu denen, die Wachstumsfaktoren verwenden. Die meisten iPSC-CMs, die durch dieses Protokoll erzeugt werden, sind ventrikuläre Kardiomyozyten, gemischt mit atrial- und knotenartigen Zellen. Die präzise Erzeugung subtypspezifischer Kardiomyozyten wird durch Feinabstimmung der späteren Differenzierungsschritte10,12erreicht. Zum Beispiel ergibt die Zugabe von RA unmittelbar nach der IWR-1-Behandlung einen hohen Prozentsatz an vorhofähnlichen Kardiomyozyten, während die RA-Hemmung die Bildung von ventrikulären iPSC-CMsfördert 18,22. Die Wnt-Signalaktivierung in einem späteren Differenzierungsstadium fördert die Induktion von kardialen Vorläuferzellen zu knotenartigen Kardiomyozyten19,21, was für die Erzeugung patientenspezifischer biologischer Schrittmacherzellen vielversprechend ist.

Menschliche iPSC-CMs sind unreif und haben eine begrenzte Proliferationsfähigkeit25. Während der embryonalen Herzentwicklung verläuft die Reifung, während die Proliferation abnimmt. Es gibt ein enges Zeitfenster, in dem iPSC-CMs für eine robuste Proliferation stimuliert werden können, die die embryonale Kardiomyozytenexpansion widerspiegelt. Hier verwenden wir einen Wnt-Aktivator CHIR99021, um die Verbreitung von frühen iPSC-CMs für einen begrenzten Zeitraum zu fördern, was mit einem aktuellen Bericht17übereinstimmt. Es wird spekuliert, dass der Wnt-Signalweg die Kardiomyozytenproliferation möglicherweise durch das Übersprechen mit mehreren upstream-Signalwegen wie NOTCH und Hippo26beeinflusst,27. Die NOTCH-Signalgebung fördert die Kardiomyozytenproliferation, während der Hippo-Signalweg das Herzwachstum und die Herzgröße28,29,30einschränkt. Es ist noch unbekannt, wie die Interaktion zwischen NOTCH und Hippo die nachgeschaltete Wnt-Aktivität bestimmt und einen angemessenen Grad an Herzproliferation feinabstimmt. Unser Protokoll hat ein interessantes Modell für die Kardiomyozytenproliferation geliefert, um Krankheitsmechanismen von angeborenen Herzfehlern zu untersuchen, die durch die Hypoplasie ventrikulärer Kardiomyozyten verursacht werden, wie das hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS) und die Lungenatresie mit intaktem ventrikulärem Septum (PA-IVS).

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde durch den Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), die Additional Ventures AVIF und SVRF Awards (M-T.Z.), die National Institutes of Health (NIH/NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 und R01HL096962 (I.D.) unterstützt. Dr. Ming-Tao Zhao wurde auch durch Startkapital des Abigail Wexner Research Institute am Nationwide Children's Hospital unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 168 periphere mononukleäre Blutzellen PBMCs humane induzierte pluripotente Stammzellen iPS-Zellen kardiale Differenzierung iPSC-Reprogrammierung Kardiomyozytenexpansion.
Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes
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Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

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