Generering og utvidelse av humane kardiomyocytter fra pasientens perifere blodmonnukleære celler
Summary
Her presenterer vi en protokoll for robust å generere og utvide humane kardiomyocytter fra pasientens perifere mononukleære celler i blodet.
Abstract
Å generere pasientspesifikke kardiomyocytter fra en enkelt blodtrekning har tiltrukket seg enorm interesse for presisjonsmedisin på kardiovaskulær sykdom. Hjertedifferensiering fra menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSCer) moduleres av definerte signalveier som er avgjørende for embryonal hjerteutvikling. Tallrike hjertedifferensieringsmetoder på 2D- og 3D-plattformer er utviklet med ulike effektiviteter og kardiomyocyttutbytte. Dette har forvirret etterforskere utenfor feltet, da mangfoldet av disse metodene kan være vanskelig å følge. Her presenterer vi en omfattende protokoll som utdyper robust generering og utvidelse av pasientspesifikke kardiomyocytter fra perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer). Vi beskriver først en høyeffektiv iPSC-omprogrammeringsprotokoll fra en pasients blodprøve ved hjelp av sendai-virusvektorer som ikke er integrasjon. Deretter detaljerer vi en liten molekylmediert monolayer differensieringsmetode som robust kan produsere slående kardiomyocytter fra de fleste menneskelige iPSC-linjer. I tillegg innføres en skalerbar kardiomyocyttutvidelsesprotokoll ved hjelp av et lite molekyl (CHIR99021) som raskt kan utvide pasientavledede kardiomyocytter for industrielle og kliniske bruksområder. På slutten er detaljerte protokoller for molekylær identifikasjon og elektrofysiologisk karakterisering av disse iPSC-CMs avbildet. Vi forventer at denne protokollen vil være pragmatisk for nybegynnere med begrenset kunnskap om kardiovaskulær utvikling og stamcellebiologi.
Introduction
Oppdagelsen av menneskeskapte pluripotente stamceller har revolusjonert moderne kardiovaskulær medisin1,2. Menneskelige iPSCer er i stand til selvfornyende og generere alle celletyper i hjertet, inkludert kardiomyocytter, endotelceller, glatte muskelceller og hjertefibroblaster. Pasient iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) kan tjene som ubestemte ressurser for modellering av genetisk arvelige kardiovaskulære sykdommer (CVDs) og testing av hjertesikkerhet for nye legemidler3. Spesielt er pasient-iPSC-CMer godt egnet til å undersøke genetiske og molekylære etiologier av CVD-er som er avledet fra defekter i kardiomyocytter, for eksempel langt QT syndrom4 og utvidet kardiomyopati (DCM)5. Kombinert med CRISPR/Cas9-mediert genomredigering har pasient-iPSC-CMer åpnet en enestående mulighet til å forstå det komplekse genetiske grunnlaget for CVD-er, inkludert medfødte hjertefeil (CHDs)6,7,8. Menneskelige iPSC-CMer har også vist potensialer for å fungere som autologe cellekilder for etterfylling av det skadede myokardiet under et hjerteinfarkt9. I de senere år har det blitt avgjørende å generere menneskelige iPSC-CMer av høy kvalitet med definerte undertyper (atrie, ventrikulær og nodal) for hjerteregenerering og legemiddeltesting10.
Hjertedifferensiering fra menneskelige iPSCer har vært sterkt avansert det siste tiåret. Differensieringsmetoder har gått fra embryoid kropp (EB)-basert spontan differensiering til kjemisk definert og rettet hjertedifferensiering11. Viktige signalmolekyler som er avgjørende for embryonal hjerteutvikling, som Wnt, BMP, Nodal og FGF, manipuleres for å forbedre kardiomyocyttdifferensiering fra human iPSC10,12. Betydelige fremskritt inkluderer sekvensiell modulering av Wnt-signalering (aktivering etterfulgt av hemming) for robust generering av kardiomyocytter fra humane iPSCer13,14. Kjemisk definerte hjertedifferensieringsoppskrifter har blitt utforsket for å lette storskala produksjon av å slå kardiomyocytter15,16, som har potensial til å bli oppgradert til industriell og klinisk nivåproduksjon. Videre oppnås robust utvidelse av tidlige menneskelige iPSC-CMer ved eksponering for konstituerende Wnt-aktivering ved hjelp av en liten kjemisk (CHIR99021)17. Senest genereres subtypespesifikke kardiomyocytter gjennom manipulering av retinoinsyre (RA) og Wnt-signalveier ved bestemte differensieringsvinduer under kardiomyocyttlinjeforpliktelse fra humane iPSCer18,19,20,21,22.
I denne protokollen beskriver vi en arbeidsprosedyre for robust generering og spredning av humane CMs som stammer fra pasientens perifere blodmonologceller. Vi presenterer protokoller for 1) omprogrammering av menneskelige PBMCer til iPSCer, 2) robust generasjon av å slå kardiomyocytter fra menneskelige iPSCer, 3) rask utvidelse av tidlige iPSC-CMer, 4) molekylær karakterisering av menneskelige iPSC-CMer, og 5) elektrofysiologisk måling av menneskelige iPSC-CMer på encellet nivå ved patch clamp. Denne protokollen dekker detaljerte eksperimentelle prosedyrer for å konvertere pasientens blodlegemer til å slå kardiomyocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under iPSC-omprogrammering er det avgjørende for kulturen PBMCs i 1 uke til de forstørres med klare kjerner og cytoplasma. Fordi PBMCer ikke sprer seg, er et passende cellenummer for viral transduksjon viktig for vellykket iPSC-omprogrammering. Celle antall PBMCer, multiplisitet av infeksjon (MOI) og titer av virus bør vurderes og justeres for å nå de optimale transduksjonsresultatene. For hjertedifferensiering er innledende såingstetthet avgjørende for at iPSC-ene skal nå over 90% sammenløp på dagen da CHIR990…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF og SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) gir 1R01HL124245, 1R01HL132520 og R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao ble også støttet av oppstartsmidler fra Abigail Wexner Research Institute ved Nationwide Children’s Hospital.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
- Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
- Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
- Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
- Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
- Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
- Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
- Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
