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Developmental Biology

रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से मानव कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन और विस्तार

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

यहां, हम रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से मानव कार्डियोमायोसाइट्स को मजबूती से उत्पन्न करने और विस्तारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एक ही रक्त ड्रा से रोगी विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स पैदा हृदय रोग पर सटीक दवा में जबरदस्त रुचि आकर्षित किया है । मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से हृदय भेदभाव परिभाषित संकेत रास्ते है कि भ्रूण हृदय के विकास के लिए आवश्यक है द्वारा संग्राहक है । 2-डी और 3-डी प्लेटफार्मों पर कई हृदय भेदभाव विधियों को विभिन्न क्षमताओं और कार्डियोमायोसाइट उपज के साथ विकसित किया गया है। यह क्षेत्र के बाहर जांचकर्ताओं हैरान है के रूप में इन तरीकों की विविधता का पालन करने के लिए मुश्किल हो सकता है । यहां हम एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से रोगी-विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स की मजबूत पीढ़ी और विस्तार को विस्तृत करता है। हम पहले गैर-एकीकरण सेंडाइ वायरस वैक्टर का उपयोग करके रोगी के रक्त नमूने से एक उच्च दक्षता वाले आईपीएससी पुनर्प्रोग्रामिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम तो विस्तार से एक छोटे से अणु मध्यस्थता मोनोलेयर भेदभाव विधि है कि मजबूती से सबसे मानव आईपीएससी लाइनों से धड़कन कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन कर सकते हैं । इसके अलावा, एक स्केलेबल कार्डियोमायोसाइट विस्तार प्रोटोकॉल एक छोटे अणु (CHIR99021) का उपयोग करके पेश किया जाता है जो औद्योगिक और नैदानिक-ग्रेड अनुप्रयोगों के लिए रोगी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का तेजी से विस्तार कर सकता है। अंत में, इन आईपीएससी-सीएम के आणविक पहचान और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल चित्रित किए गए हैं। हम इस प्रोटोकॉल हृदय विकास और स्टेम सेल जीव विज्ञान पर सीमित ज्ञान के साथ शुरुआती लोगों के लिए व्यावहारिक होने की उम्मीद करते हैं।

Introduction

मानव प्रेरित पीएलयूरिपोटेंट स्टेम सेल की खोज ने आधुनिक हृदय चिकित्सा में क्रांति ला दी है1,2. मानव आईपीएससी हृदय में सभी कोशिका प्रकारों को आत्म-नवीनीकरण और उत्पन्न करने में सक्षम हैं, जिनमें कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाएं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं। रोगी आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) आनुवंशिक रूप से विरासत में मिलने वाले हृदय रोगों (सीवीडी) मॉडलिंग और नईदवाओंके लिए हृदय सुरक्षा का परीक्षण करने के लिए अनिश्चित संसाधनों के रूप में काम कर सकते हैं। विशेष रूप से, रोगी आईपीएससी-सीएम सीवीडी के आनुवंशिक और आणविक इटियोलॉजी की जांच करने के लिए अच्छी तरह से तैयार हैं जो कार्डियोमायोसाइट्स में दोषों से प्राप्त होते हैं, जैसे लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोम4 और डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम)5। CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन के साथ संयुक्त, रोगी आईपीएससी-सीएम ने जन्मजात हृदय दोषों(CHDs)6,7,8सहित सीवीडी के जटिल आनुवंशिक आधार को समझने के लिए एक अभूतपूर्व अवसर खोला है । मानव आईपीएससी-सीएम ने दिल का दौरा पड़ने केदौरानक्षतिग्रस्त मायोकार्डियम की भरपाई के लिए ऑटोलॉगस सेल स्रोतों के रूप में सेवा करने की क्षमता भी प्रदर्शित की है । हाल के वर्षों में, कार्डियक पुनर्जनन और दवा परीक्षण10के लिए परिभाषित उपप्रकार (एट्रियल, वेंट्रिकुलर और नोडल) के साथ उच्च गुणवत्ता वाले मानव आईपीएससी-सीएम उत्पन्न करना सर्वोपरि हो गया है।

मानव आईपीएससी से हृदय भेदभाव पिछले एक दशक में बहुत उन्नत किया गया है । भ्रूणीय शरीर (ईबी) आधारित सहज भेदभाव से रासायनिक रूप से परिभाषित और निर्देशित हृदय भेदभाव11तक भेदभाव के तरीके चले गए हैं । मानव आईपीएससी10, 12से कार्डियोमायोसाइट भेदभाव को बढ़ाने के लिए भ्रूणीय हृदय विकास के लिए आवश्यक प्रमुख सिग्नलिंग अणुओं, जैसे डब्ल्यूएनटी,बीएमपी,नोडल और एफजीएफ में हेरफेर कियाजाताहै। महत्वपूर्ण अग्रिमों में मानव आईपीएससी13,14से कार्डियोमायोसाइट्स के मजबूत उत्पादन के लिए डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग (अवरोध के बाद सक्रियण) का अनुक्रमिक मॉड्यूलेशन शामिल है। रासायनिक रूप से परिभाषित हृदय विभेदन व्यंजनों का पता लगाया गया है ताकि कार्डियोमायोसाइट्स15, 16को मात देने के बड़े पैमाने पर उत्पादन को सुविधाजनक बनाया जा सके, जिसमें औद्योगिक और नैदानिक स्तर के उत्पादन में उन्नत होने की क्षमता है। इसके अलावा, प्रारंभिक मानव आईपीएससी-सीएम का मजबूत विस्तार एक छोटे रसायन (CHIR99021)17का उपयोग करके संविलियन डब्ल्यूएनटी सक्रियण के संपर्क में आने से प्राप्त होता है। हाल ही में, मानव आईपीएससी18, 19,20,21, 22से कार्डियोमायोसाइट वंश प्रतिबद्धता के दौरान विशिष्ट विभेदन खिड़कियों पर रेटिनोइक एसिड(आरए)और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग रास्तों में हेरफेर के माध्यम से उपप्रकार-विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न होते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से निकलने वाले मानव सीएम की मजबूत पीढ़ी और प्रसार के लिए एक कार्य प्रक्रिया का विस्तार करते हैं। हम 1) के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं) मानव पीबीएमसी को आईपीएससी, 2) मानव आईपीएससी से धड़कने की मजबूत पीढ़ी, 3) प्रारंभिक आईपीएससी-सीएमएस का तेजी से विस्तार, 4) मानव आईपीएससी-सीएमएस का आणविक लक्षण वर्णन, और 5) मानव आईपीएससी-सीएमएस का इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापन पैच क्लैंप द्वारा एकल सेल स्तर पर। इस प्रोटोकॉल में रोगी रक्त कोशिकाओं को कार्डियोमायोसाइट्स की धड़कन में बदलने पर विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रियाओं को शामिल किया गया है।

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Protocol

प्रायोगिक प्रोटोकॉल और मानव विषयों के लिए सूचित सहमति को राष्ट्रव्यापी बाल अस्पताल में संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. सेल संस्कृति मीडिया, समाधान, और अभिकर् स की तैयारी

  1. पीबीएमसी मीडिया तैयार करें
    1. बेसल पीबीएमसी कल्चर मीडिया (1x) के 20 एमएल और सप्लीमेंट के 0.52 एमएल मिलाएं। एससीएफ और FLT3 प्रत्येक के 20 μL जोड़ें (स्टॉक एकाग्रता: १०० μg/mL), 4 μL के IL3, IL6 और EPO प्रत्येक (स्टॉक एकाग्रता: १०० μg/mL) और एल-ग्लूटामाइन वैकल्पिक (100x) के २०० μL । इन्हें अच्छी तरह मिला लें। 0.22-μm फ़िल्टर यूनिट का उपयोग करके बाँझ हुड में फ़िल्टर करें। इसे पूर्ण रक्त मीडिया के रूप में नाम करें।
    2. बेसल पीबीएमसी कल्चर मीडिया (1x) के 20 एमएल और सप्लीमेंट के 0.52 एमएल मिलाएं। एल-ग्लूटामाइन विकल्प (100x) के 200 माइक्रोल जोड़ें। इन्हें अच्छी तरह मिला लें। 0.22-μm फ़िल्टर यूनिट का उपयोग करके फ़िल्टर करें। पूरक रक्त मीडिया के रूप में इस नाम।
  2. पूरा E8 मीडिया तैयार करें
    1. ई 8 बेसल मीडिया के 500 मिलीएल और ई 8 पूरक के 10 मिलीएल (4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गल) पूर्ण E8 मीडिया बनाने के लिए मिलाएं। उपयोग से पहले कमरे के तापमान (आरटी) तक समतुल्य।
  3. आईपीएससी पासिंग मीडिया तैयार करें
    1. वाई-27632 रॉक अवरोधक (1:5,000 कमजोर पड़ने, स्टॉक एकाग्रता: 10 mM) के 40 μL पूर्ण E8 मीडिया के 200 मिलीएल में जोड़ें। इसे अच्छी तरह मिला लें। उपयोग से पहले आरटी को समतुल्य करें।
  4. कार्डियोमायोसाइट विभेदन मीडिया तैयार करें
    1. मीडिया I: B27 माइनस इंसुलिन सप्लीमेंट (50x) के 10 एमएल के साथ RPMI1640 के 500 एमएल मिलाएं।
    2. मीडिया II: मीडिया I (CHIR99021 6 μM की अंतिम एकाग्रता) के लिए मीडिया I (GSK3 अवरोधक) स्टॉक की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें। अच्छी तरह मिला लें।
    3. मीडिया III: आईडब्ल्यूआर-1 (डब्ल्यूएनटी अवरोधक) स्टॉक की उचित मात्रा मीडिया I (आईडब्ल्यूआर-1 5 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता) में जोड़ें। अच्छी तरह मिला लें।
    4. मीडिया IV: B27 पूरक (50x) के 10 एमएल के साथ RPMI1640 के 500 एमएल मिलाएं। अच्छी तरह मिला लें।
    5. मीडिया वी: B27 पूरक (50x) के 10 मिलीएल के साथ RPMI1640 (कोई ग्लूकोज) के 500 मिलीएल मिलाएं। अच्छी तरह मिला लें।
    6. मीडिया VI: मीडिया IV (CHIR99021 2 μM की अंतिम एकाग्रता) के लिए चिर99021 स्टॉक की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें। अच्छी तरह मिला लें।
  5. आईपीएससी-सीएम पासिंग मीडिया तैयार करें
    1. मीडिया चतुर्थ (KSR अंतिम एकाग्रता: 10%) के 90 मिलीएल के लिए नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (केएसआर) के 10 एमएल जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं।
  6. आईपीएससी-सीएम फ्रीजिंग मीडिया तैयार करें
    1. केएसआर के 9 एमएल में डीएमएसओ का 1 एमएल जोड़ें (अंतिम सांद्रता: 10% DMSO/90% KSR) और अच्छी तरह से मिलाएं।
  7. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मध्यम लेपित प्लेटें तैयार करें
    1. गल बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर और 1.5 एमएल ट्यूबों में aliquot। डीएमईएम/एफ 12 मीडिया (1:250 कमजोर पड़ने) के 250 एमएल में इस माध्यम का 1 एमएल जोड़ें और उन्हें अच्छी तरह से मिलाएं। 6-वेल प्लेट में पतला समाधान प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलन करें और उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में इनक्यूबेट करें।

2. पीपीएमसी का आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग

  1. ब्लड सैंपल से अलग पीबीएमसी।
    1. रोगी रक्त के नमूने (~ 5 एमएल) ले लीजिए और रक्त कोशिका जुदाई ट्यूबों में स्थानांतरित (सामग्री की तालिकादेखें)। 10x उलटा करके मिलाएं।
    2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    3. ट्यूबों को ध्यान से बाहर निकालें और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। एक जैव सुरक्षा हुड के तहत, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (बफी परत) को परेशान किए बिना टोपियां हटा दें। पीबीएमसी प्लाज्मा परत(चित्रा 1A)के ठीक नीचे एक सफ़ेद परत में होगा। 1000 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके पूरी बफी परत को इकट्ठा करें और 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    4. स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल नंबर गिनें। आरटी में 25 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब स्पिन करें।
    5. सुपरनेट को त्याग दें। डीपीबीएस (सीए2+ /एमजी 2 +मुक्त) के10 मिलीलन के साथ धोएं।
    6. आरटी में 15 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब स्पिन करें।
    7. सुपरनिट निकालें। फ्रीजिंग मीडिया (केएसआर प्लस 10% डीएमएसओ) के 1 एमसीएल में सेल छर्रों को रिसाल्ड करें। प्रति शीशी 1 x 106 कोशिकाओं को बनाने के लिए सेल घनत्व को समायोजित करें।
    8. एक सेल फ्रीजिंग कंटेनर में पीबीएमसी क्रायोवियल रखें और रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। अगले दिन लंबे समय तक भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।
  2. आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग।
    1. एक 15 एमएल शंकु नली में पूरक रक्त मीडिया के 3 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पीबीएमसी गल और उन्हें एक शंकु नली में स्थानांतरित करें। आरटी में 7 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन करें।
    2. सुपरनेट को त्याग दें। पूर्ण रक्त मीडिया के साथ पीबीएमसी को फिर से रीसुस्ल करें। उन्हें 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों (कोई तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) के दो कुओं में बीज।
    3. रात 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में इनक्यूबेट। अगले दिन धीरे पुराने मीडिया (0.5 मिलीलीटर) के आधे को हटा दें और ताजा पूर्ण रक्त मीडिया के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. पुराने मीडिया के आधे ताज़ा द्वारा हर दूसरे दिन मीडिया बदलें ।
    5. एक सप्ताह के बाद, पूरक रक्त मीडिया के 1 एमएल के साथ अच्छी तरह से अच्छी तरह से धोएं और कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. सेल नंबर गिनें। 7 मिनट के लिए 2 x10 5 कोशिकाओं और 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र लें।
    7. सुपरनेट को त्याग दें। पूर्ण रक्त मीडिया के 300 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से पेंड करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेंडाइ वायरस रीप्रोग्रामिंग वैक्टर की उचित मात्रा जोड़कर ट्रांसफैक्शन करें। उन्हें 24-अच्छी प्लेट (कोई तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) के एक कुएं में स्थानांतरित करें। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में इनक्यूबेट।
    8. अगले दिन 7 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन। पूर्ण रक्त मीडिया के 2 एमसीएल में सुपरनैंट और रिसिपेंड निकालें। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के साथ पूर्व-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें। यह 1 दिन (D1) है ।
    9. अगले दिन थाली को न छुएं।
    10. D3 पर, पुराने मीडिया के 1 एमसीएल निकालें। पूरक रक्त मीडिया के 1 एमसीएल जोड़ें।
    11. D5 पर 2.2.10 चरण दोहराएं।
    12. D7 पर, पुराने मीडिया के 1 एमसीएल को हटा दें। पूर्ण E8 मीडिया के 1 ml जोड़ें।
    13. D8 पर, दोहराने कदम 2.2.12।
    14. D9 पर, पुराने मीडिया को हटा दें। पूर्ण E8 मीडिया के 2 एमसीएल जोड़ें। पूरी तरह से पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाओं को संलग्न करने और उपनिवेशों का गठन शुरू करने की उम्मीद है।
    15. हर दिन पूर्ण E8 मीडिया के 2 एमसीएल के साथ ताज़ा करें।
    16. सेंडाइ वायरस ट्रांसडक्शन के लगभग 2 सप्ताह बाद, बड़ी आईपीएससी कॉलोनियां दिखाई देंगी और चुनने के लिए तैयार हो जाएंगी ।
    17. हुड में स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत आईपीएससी कॉलोनियों में कटौती करें और आईपीएससी पासेजिंग मीडिया के 0.5 मिलील के साथ अलग-अलग कॉलोनियों को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 24-वेल प्लेट प्री-लोडेड में स्थानांतरित करें।
    18. हर दिन पूर्ण E8 मीडिया के 0.5 मिलील के साथ ताज़ा करें जब तक कि आईपीएससी उपनिवेश एक नए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6-अच्छी प्लेट में पासिंग के लिए काफी बड़े हो जाते हैं।

3. मानव आईपीएससी रखरखाव और पासिंग

  1. जब मानव आईपीएससी 90% से अधिक योग्यता तक पहुंचते हैं, तो पुराने मीडिया को हटा दें। डीपीबीएस के 3 एमएल के साथ एक बार कुल्ला।
  2. डीपीबीएस समाधान में 0.5 m EDTA का 1 मिलियन मिलियन जोड़ें। 5% सीओ2 में 5-8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. आकांक्षा द्वारा EDTA निकालें। आईपीएससी पासिंग मीडिया के 1 एमएल जोड़ें। मैन्युअल रूप से आईपीएससी को उखाड़ फेंकना।
  4. एकल सेल निलंबन के 600-900 μL ले लो और फिर से उन्हें एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर प्लेट-लेपित 6-अच्छी तरह से थाली (कमजोर पड़ने: 1:6 से 1:10) । रात 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में इनक्यूबेट।
  5. हर दिन पूर्ण E8 मीडिया के 2 एमसीएल के साथ ताज़ा करें। आईपीएससी संस्कृतियां आमतौर पर 3-4 दिनों के बाद नरमी तक पहुंचती हैं।

4. रासायनिक रूप से परिभाषित कार्डियोमायोसाइट भेदभाव

  1. संस्कृति मानव आईपीएससी पूरा E8 मीडिया में जब तक 95% confluent (3-4 दिन) ।
  2. पुराने मीडिया को हटा दें। 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में सीएम विभेदन मीडिया II (RPMI1640 प्लस B27 माइनस इंसुलिन सप्लीमेंट में 6 माइक्रोन चिर) के 2 एमसीएल जोड़ें। यह डी0 है। D1 पर स्पर्श न करें।
  3. D2 पर, सीएम विभेदन मीडिया I (RPMI1640 प्लस B27 ऋण इंसुलिन पूरक) के 2 एमसीएल के साथ बदलें।
  4. D3 पर, सीएम विभेदन मीडिया III के 2 एमसीएल के साथ बदलें (RPMI1640 प्लस B27 माइनस इंसुलिन पूरक में 5 μM IWR-1)। D4 पर स्पर्श न करें।
  5. D5 पर, मुख्यमंत्री भेदभाव मीडिया I के 2 एमसीएल के साथ बदलें।
  6. D7 पर, सीएम विभेदन मीडिया IV (RPMI1640 प्लस B27 पूरक) के 2 एमसीएल के साथ बदलें। इसके बाद हर दूसरे दिन मीडिया को रिफ्रेश करें।
  7. D11 पर जब अनुबंध कोशिकाओं को देखा जाता है, तो सीएम विभेदन मीडिया वी (कोई ग्लूकोज) के 2 एमसीएल के साथ बदलें।
  8. D13 पर, मुख्यमंत्री भेदभाव मीडिया V के 2 एमसीएल के साथ बदलें।
  9. D15 पर, सीएम विभेदन मीडिया IV के 2 एमसीएल के साथ बदलें।
  10. D17-D21 पर, हर दूसरे दिन सीएम विभेदन मीडिया चतुर्थ के 2 एमसीएल के साथ बदलें।

5. मार्ग मानव आईपीएससी-सीएम

  1. एक बार डीपीबीएस के 3 एमएल के साथ पुराने मीडिया और कुल्ला कोशिकाओं को हटा दें।
  2. 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं पर सीएम वियोजन समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) के 1 एमसीएल लागू करें। 5% सीओ2 में 5-8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. मैकेनिकल रूप से आईपीएससी-सीएम को जोरदार पाइपिंग करके एकल कोशिकाओं में अलग करें।
  4. कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। सीएम डिसोर्सेशन सॉल्यूशन को बेअसर करने के लिए सीएम पासिंग मीडिया (आरएमपीआई1640 प्लस बी27 सप्लीमेंट में 10% केएसआर) के 2 एमसीएल जोड़ें।
  5. आरटी में 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें।
  6. सुपरनेट को त्याग दें। सीएम पासिंग मीडिया की वांछित मात्रा के साथ कोशिकाओं को फिर से उठाया। उन्हें एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेट/डिश में बीज । मानव आईपीएससी-सीएम पासिंग के 1-3 दिन बाद फिर से पिटाई शुरू करते हैं ।

6. मानव आईपीएससी-सीएम का विस्तार

  1. कुल्ला D10-12 एक बार एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के लिए DPBS के 3 एमएल के साथ बीटिंग आईपीएससी-सीएमएस । सीएम वियोजन समाधान (चरण 5.2) का 1 एमएल जोड़ें। 5% सीओ2 में 7-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. मैकेनिकल रूप से आईपीएससी-सीएम को जोरदार पाइपिंग करके एकल कोशिकाओं में अलग करें।
  3. कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। सीएम के 2 एमएल को जोड़ा मीडिया को बेअसर करने के लिए सीएम डिसमिला समाधान।
  4. आरटी में 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें।
  5. सुपरनेट को त्याग दें। सीएम पासिंग मीडिया की उचित मात्रा के साथ कोशिकाओं को पुनर्सुल व्यय करें। सिंगल सेल सस्पेंशन बनाने के लिए पिपेट अप और डाउन। बीज एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में आईपीएससी-सीएम के एक लाख-10 सेमी पकवान लेपित ।
  6. अगले दिन पुराने मीडिया को हटा दें । कार्डियोमायोसाइट प्रसार मीडिया के 10 एमएल जोड़ें (मीडिया VI: 2 μM CHIR99021)। हर दूसरे दिन मीडिया बदलें।
  7. जब आईपीएससी-सीएम 7-9 दिनों की संस्कृति के बाद ढुलमुल हो जाते हैं, तो आईपीएससी-सीएम के आगे विस्तार के लिए पासिंग कदम दोहराएं ।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने से पहले, बीज आईपीएससी-सीएम बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित कवर्लिप्स पर जो 24 अच्छी प्लेट (सीडिंग घनत्व: 0.5-1 x 106 कोशिकाओं/एमएल) में रखे गए हैं। कम से कम 4 दिनों तक संस्कृति में आईपीएससी-सीएम बनाए रखें।
  2. डीपीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करके कोशिकाओं को एक बार धोएं।
  3. आरटी में 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का 0.5 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेट करें।
  4. डीपीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करके कोशिकाओं को धोएं। एक बार दोहराएं।
  5. 0.1% ट्राइटन एक्स-100 का 0.5 मिलियन जोड़ें और आरटी में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार धोएं।
  7. डीपीबीएस (ब्लॉकिंग सॉल्यूशन) में 0.2% बीएसए का 0.5 एमएल जोड़ें। 1 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  8. अवरुद्ध समाधान (कमजोर पड़ने: 1:400-1:1000) के साथ पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 माइक्रोन जोड़ें। रात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  9. मिलाते हुए 3 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान के 0.5 एमएल का उपयोग कर कोशिकाओं को धोएं। दो बार दोहराएं।
  10. अवरुद्ध समाधान में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 माइक्रोन जोड़ें। 1 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  11. डीपीबीएस के 0.5 एमएल के साथ तीन बार कोशिकाओं को कुल्लाएं, प्रत्येक मिलाते हुए के साथ 3 मिनट के लिए।
  12. DAPI (1:2000 कमजोर पड़ने) के साथ काउंटरटाइन नाभिक और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  13. डीपीबीएस के 0.5 एमएल के साथ तीन बार कोशिकाओं को कुल्ला।
  14. बढ़ते मीडिया के 5 माइक्रोन का उपयोग करके एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कवरस्लिप पर माउंट कोशिकाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और प्रकाश से बचाते हैं।

8. फ्लो साइटोमेट्री नमूना तैयार करना

  1. एक बार डीपीबीएस के 3 एमएल के साथ मानव आईपीएससी-सीएम धोएं।
  2. सीएम के 1 मिलीएल को डिससोएशन सॉल्यूशन और 7-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में इनक्यूबेट करें।
  3. 1,000-μL पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना। एक छलनी टोपी के माध्यम से एक दौर FACS ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण। एंजाइम गतिविधि को बेअसर करने के लिए आईपीएस ट्यूब आईपीएससी-सीएम पासेजिंग मीडिया (10% केएसआर) के 1 एमसीएल से पहले से भरा हुआ है।
  4. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें।
  5. सेल गोली परेशान बिना सुपरनैंट निकालें। फिक्सेशन/पर्मेबिलाइजेशन सॉल्यूशन के 250 माइक्रोन जोड़ें (सामग्री की टेबल देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. पेर्म/वॉश बफर का 1 एमसीएल डालें। भंवर संक्षेप में और 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन।
  7. सुपरनेट को त्याग दें। 1x Perm/वॉश बफर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (1:200-1:500) के 100 माइक्रोन जोड़ें। भंवर संक्षेप में और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  8. पेर्म/वॉश बफर के 1 एमसीएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। भंवर संक्षेप में और 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन।
  9. सुपरनेट को त्याग दें। पतला माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500-1:1,000) के 100 माइक्रोन जोड़ें। भंवर संक्षेप में और 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट । यदि माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश-संवेदनशील फ्लोरेसेंस के साथ संयुग्मित हैं तो प्रकाश से बचाएं।
  10. पेर्म/वॉश बफर के 1 एमसीएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। भंवर संक्षेप में और 4 मिनट के लिए 300g पर स्पिन ।
  11. सुपरनेट को त्याग दें। 400 μL FACS धुंधला बफर (PBS/4% FBS) के साथ रीसुस्पेंड कोशिकाओं। एक FACS साधन के लिए लोड होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

9. रियल टाइम क्यूपीसीआर

  1. मानव आईपीएससी-सीएम कल्चर में पुराने मीडिया को हटाएं। कोशिकाओं को लाइसेट करने के लिए लाइसिस बफर के 500-700 माइक्रोन जोड़ें। आरटी स्केप सेल में 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट और 1.5 मिलीलीटर RNase-मुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें। कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए तुरंत आगे बढ़ें या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. निर्माता के निर्देश का पालन करते हुए आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कुल आरएनए को अलग करें।
  3. आरएनए एकाग्रता को मापें और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा कुल आरएनए की गुणवत्ता का आकलन करें।
  4. सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया करें। आरटी रिएक्शन की कुल मात्रा 20 माइक्रोन है जिसमें 4 माइक्रोन ऑफ रिएक्शन मिक्स (5x), रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का 1 माइक्रोन, कुल आरएनए का 1 माइक्रोन और आरएनएएस-मुक्त पानी शामिल है।
  5. निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके थर्मल साइकिलर में पूर्ण आरटी प्रतिक्रिया मिश्रण को कम करें: 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस; 20 मिनट के लिए 46 डिग्री सेल्सियस; 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
  6. नाभिक मुक्त पानी का उपयोग करके 1:10 तक पतला सीडीएनए। सीडीएनए टेम्पलेट के 1 माइक्रोन, प्राइमर/प्रोब के 1 माइक्रोन, क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स के 10 माइक्रोन और नाभिक मुक्त पानी के 8 माइक्रोन मिलाकर रियल टाइम क्यूपीसीआर रिएक्शन सेट करें ।
  7. रियल टाइम पीसीआर सिस्टम में चलाएं। साइकिलिंग प्रोटोकॉल 50 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट (होल्ड), 95 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट (होल्ड), 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 40 चक्रों के लिए दोहराएं।
  8. प्रत्येकनमूने में प्रत्येक जीन के लिए सी टी मान ले लीजिए। सापेक्ष एमआरएनए बहुतायत की गणना हाउसकीपिंग जीन के सीटी मूल्य से लक्ष्य जीन के सीटी मूल्य को घटाकर की जाती है। सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति 2-Τ ΤCT विधि द्वारा विश्लेषण किया जाता है।

10. पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग

  1. पहले वर्णित सीएम वियोजन समाधान का उपयोग करके आईपीएससी-सीएम को एकल कोशिकाओं में अलग करें।
  2. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित कवर्लिप्स पर कम घनत्व पर बीज कोशिकाएं। मीडिया चतुर्थ में 3-4 दिनों के लिए उन्हें संस्कृति।
  3. क्षैतिज माइक्रोइलेक्ट्रोड पुलर का उपयोग करके बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से पिपेट (प्रतिरोध 0.9-1.5 एमΩ) खींचें।
  4. टायरोड के समाधान (पीएच = 7.35) में इनक्यूबेट कोशिकाएं।
  5. निम्नलिखित रसायनों से बना इलेक्ट्रोड समाधान (पीएच= 7.3) के साथ पिपेट भरें: 120 m m aspartic एसिड, 20 एमएमएम केसीएल, 2 एमएमएम एमजीसीएल2,5 एमएम एचईपीई, 10 एमएमएम एनएसीएल, 5 एमएम ईजीटीए, 03 एमएम एनए-जीटीपी, 14 एमएम फॉस्फोक्रेटिन, 4 एमएम के-एटीपी और 2mM क्रिएटिन फॉस्फोकिनेज।
  6. 1 हर्ट्ज पर 1.5-2 डायस्टोलिक थ्रेसहोल्ड 5 एमएस करंट पल्स का उपयोग करके वर्तमान क्लैंप मोड में कोशिकाओं को रखें।
  7. माइक्रोइलेक्ट्रोड एम्पलीफायर और सॉफ्टवेयर-संचालित अधिग्रहण बोर्ड का उपयोग करके रिकॉर्ड एक्शन क्षमता (एपीएस)।

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Representative Results

पीबीएमसी से मानव आईपीएससी पुनर्प्रोग्रामिंग
7 दिनों के लिए पूर्ण रक्त मीडिया के साथ पूर्व संस्कृति के बाद, PBMCs दिखाई नाभिक और साइटोप्लाज्म(चित्रा 1B)के साथ बड़े हो जाते हैं, यह दर्शाता है कि वे वायरस ट्रांसफैक्शन के लिए तैयार हैं । सेंडाइ वायरस रीप्रोग्रामिंग कारकों के साथ ट्रांसफैक्शन के बाद, पीबीएमसी को एक और सप्ताह के लिए एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग प्रक्रिया से गुजरना होगा। आमतौर पर, हमें 1 x 10 5 पीबीएमसी के ट्रांसफैक्शन से30-50 आईपीएससी कॉलोनियां मिलती हैं और रीप्रोग्रामिंग दक्षता 0.03%-0.05% है। पूरी तरह से रीप्रोग्राम्ड कोशिकाएं पूरी तरह से ई 8 मीडिया(चित्रा 1C)में पेश किए जाने पर उपनिवेशों का गठन करना शुरू कर देंगी। इन प्रारंभिक आईपीएससी कॉलोनियों को एक और 7 दिनों के लिए विस्तारित किया जाता है और फिर यांत्रिक रूप से कटौती की जाती है और व्यक्तिगत रूप से उठाया जाता है। प्रत्येक आईपीएससी कॉलोनी को व्यक्तिगत आईपीएससी लाइनों को स्थापित करने के लिए 6-अच्छी प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित किया जाता है। 4-5 मार्ग के बाद, आईपीएससी कॉलोनियां बहुत कम विभेदित कोशिकाओं(चित्रा 1D) केसाथ शुद्ध हो जाएंगी। इस स्तर पर, आईपीएससी कॉलोनियों में अधिकांश कोशिकाएं OCT4 और NANOG सकारात्मक(चित्रा 1E)हैं, जो उनकी बहुलता का प्रदर्शन करती हैं। स्थिर आईपीएससी लाइनें पांचवें मार्ग से स्थापित की जाती हैं।

कार्डियक भेदभाव
कार्डियक विभेदन प्रोटोकॉल को चित्र 1एफमें दर्शाया गया है । जब आईपीएससी को कम से कम 10 मार्गों के लिए बनाए रखा जाता है तो कार्डियक भेदभाव शुरू किया जाता है। जब CHIR99021 लागू किया जाता है तो आईपीएससी की योग्यता की डिग्री महत्वपूर्ण होती है। सेल घनत्व 90% से अधिक कॉन्फ्ल्यूंट है लेकिन अधिक कॉन्फ्लूंट नहीं है। यदि आईपीएससी कालोनियों में बहुत भीड़ हो जाती है, तो वे सहज भेदभाव शुरू कर देंगे जो निर्देशित कार्डियोमायोसाइट भेदभाव दक्षता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा। धड़कन कार्डियोमायोसाइट्स आमतौर पर भेदभाव के 12 दिन के बाद मनाया जाता है(वीडियो 1)। जिस तारीख में पिटाई की शुरुआत होती है, वह अलग-अलग होती है और उपयोग में आईपीएससी लाइनों पर निर्भर होती है। ग्लूकोज भुखमरी और रिपीटिंग के बाद, आईपीएससी-सीएम सहज पिटाई(वीडियो 2)और इंटरकैलेटेड कार्डियक ट्रोपोनिन टी (टीएनटी2) और α-ऐक्टिन(चित्रा 1G-H)के साथ गठबंधन सारकोमी संरचना दिखाते हैं । इसके अलावा, आईपीएससी-सीएम की शुद्धता अधिक है, जिसमें 93% से अधिक कोशिकाएं टीएनएनटी2+ हैं जैसा कि FACS विश्लेषण(चित्रा 1I)द्वारा दिखाया गया है।

यद्यपि आईपीएससी-सीएम वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स की तुलना में अपेक्षाकृत अपरिपक्व होते हैं, वे पूरे सेल पैच क्लैंप(चित्रा 2 ए,बी)द्वारा मापा गया वेंट्रिकुलर और एट्रियल जैसी कार्रवाई क्षमता दिखाते हैं। एक विशिष्ट हृदय विभेदन में, दिन 30 आईपीएससी-सीएम वेंट्रिकुलर-, एट्रियल-और नोडल जैसे उपप्रकारों का मिश्रण हैं, जिसमें बहुमत के लिए वेंट्रिकुलर सीएम लेखांकन (60%, चित्रा 2 सी)उपरोक्त भेदभाव प्रोटोकॉल(चित्रा 1F)का उपयोग करके हैं। विभिन्न विभेदक प्रोटोकॉल सेल वंश निर्धारण10के दौरान सक्रियण के अलग संकेत के कारण कार्डियोमायोसाइट उपप्रकार के अलग प्रतिशत उपज । वेंट्रिकुलर सीएम MYL2 (MLC2v, चित्रा 2D)के साथ लेबल कर रहे हैं, जबकि एट्रियल आईपीएससी-सीएम NR2F2 (तख्तापलट-TFII, चित्रा 2E)द्वारा चिह्नित कर रहे हैं । ये मार्कर प्रारंभिक चरण के बजाय अधिक परिपक्व आईपीएससी-सीएम (>D30) में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं।

डब्ल्यूएनटी एक्टिवेशन द्वारा आईपीएससी-सीएम का विस्तार
स्तनधारियों में, वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स सक्रिय रूप से आत्म-नवीकरण के लिए विभाजित नहीं होते हैं। यह घटना मानव आईपीएससी-सीएम के लिए भी होती है । एक बार D30 से परे परिपक्व, आईपीएससी-सीएम के सेल विभाजन एक दुर्लभ घटना है, इस प्रकार नैदानिक और औद्योगिक स्तर के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अपनी क्षमता सीमित । भ्रूण कार्डियोमायोसाइट प्रसार के दौरान विकासात्मक वातावरण की नकल करने के लिए, हम प्रारंभिक आईपीएससी-सीएम के गुणा को प्रोत्साहित करने के लिए चिर99021 द्वारा Wnt मार्ग को सक्रिय करते हैं। D12-14 आईपीएससी-सीएम (ग्लूकोज अभाव द्वारा शुद्धि के बाद) 2 μM CHIR99021 की उपस्थिति में एक कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । डब्ल्यूएनटी एक्टिवेशन आईपीएससी-सीएम के सेल डिवीजन को उत्तेजित करता है और सेल चक्र नियामकों जैसे साइक्लिन डी 1(चित्रा 3 ए)की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है जो कोशिका चक्र को जी 1 चरण के माध्यम से आगे बढ़ने के लिए धक्का दे सकता है। दिलचस्प बात यह है कि CHIR99021 नियंत्रण(चित्रा 3B)की तुलना में 2 मार्गों के लिए प्रारंभिक आईपीएससी-सीएम के मजबूत प्रसार को सक्षम बनाता है। हालांकि, आईपीएससी-सीएम की प्रसार क्षमता व्यापक मार्ग(चित्रा 3B)के साथ घटती है, जो भ्रूणीय हृदय विकास के दौरान सीमित और अच्छी तरह से नियंत्रित हृदय प्रसार के अनुरूप है। इसके अलावा, यह प्रतीत नहीं होता है कि CHIR99021 अधिक परिपक्व आईपीएससी-सीएम के विस्तार को प्रोत्साहित करने में सक्षम है जब वे भेदभाव के 30 दिनों से अधिक तक पहुंचने और स्थिर सारकोमेरे संरचनाओं का विकास ।

Figure 1
चित्रा 1:मानव आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग और कार्डियोमायोसाइट भेदभाव। (ए)रोगी के रक्त नमूनों को अलग करने के बाद पीबीएमसी परत को दिखाने वाला एक योजनाबद्ध आरेख । (ख)बढ़े हुए पीबीएमसी ट्रांसफेक्शन के लिए तैयार हैं। (ग)प्रारंभिक मानव आईपीएससी कॉलोनियां । (घ)मार्ग 5 पर एक स्थापित आईपीएससी लाइन । (ई)मानव आईपीएससी pluripotency मार्कर OCT4 (ग्रीन) और NANOG (लाल) के लिए सकारात्मक हैं । नाभिक दापी (नीला) द्वारा दागदार हैं। (F)कार्डियोमायोसाइट विभेदन प्रोटोकॉल का अवलोकन। (जी-एच) आईपीएससी-सीएम की सारकोमर संरचना टीएनएनटी2 (ग्रीन) और α-ऐक्टिनिन (लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा प्रकट की गई है। नाभिक दापी (नीला) द्वारा दागदार हैं। (I)टीएनएनटी2 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके आईपीएससी-सीएम का एफएएफएस विश्लेषण। स्केल बार: 200 माइक्रोन(बी-डी),50 माइक्रोन(ई और जी)और 20 माइक्रोन(एच)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:मानव आईपीएससी-सीएम में कार्डियोमायोसाइट उपप्रकार। (ए-बी)वेंट्रिकुलर-जैसे(ए)और एट्रियल-जैसे(बी)आईपीएससी-सीएम के लिए प्रतिनिधि कार्रवाई संभावित अवधि । (ग)मानव आईपीएससी-सीएम में वेंट्रिकुलर-, एट्रियल और नोडल जैसे उपप्रकारों के प्रतिनिधि प्रतिशत । (D-E) D30 आईपीएससी-सीएम वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट मार्कर MYL2(D)और एट्रियल मार्कर एनआर 2एफ2(ई)के खिलाफ एंटीबॉडी से सना हुआ है। कोशिकाओं को एक साथ एक TNNT2 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं । नाभिक दापी (नीला) द्वारा दागदार हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन(डी-ई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-डब्ल्यूएनटी एक्टिवेशन द्वारा मानव आईपीएससी-सीएम का विस्तार। (A)चिरह99021 की उपस्थिति में साइक्लिन डी1 पॉजिटिव आईपीएससी-सीएम का प्रतिशत बढ़ा है। कोशिकाओं को टीएनएनटी2 (लाल) और साइक्लिन डी 1 (हरे रंग) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ डबल दाग दिया जाता है। नाभिक दापी (नीला) द्वारा दागदार हैं। (ख)पहले 3 मार्गों में चिरह99021 के साथ या बिना मानव आईपीएससी-सीएम के विस्तार के दौरान सेल संख्या गुना परिवर्तन । वाई-एक्सिस सेल नंबर गुना परिवर्तन दिखाता है। चिरह99021 प्रारंभिक आईपीएससी-सीएम के मजबूत प्रसार को उत्तेजित करता है। स्केल बार: 50 माइक्रोन(ए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1. भेदभाव के दिन 18 में मानव आईपीएससी-सीएम की पिटाई। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2. मेटाबोलिक शुद्धि के बाद 25 दिन में मानव आईपीएससी-सीएम की पिटाई। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग के दौरान, यह 1 सप्ताह के लिए संस्कृति पीबीएमसी के लिए महत्वपूर्ण है जब तक कि वे स्पष्ट नाभिक और साइटोप्लाज्म के साथ बढ़े हुए नहीं हैं। चूंकि पीबीएमसी पैदा नहीं होता है, इसलिए सफल आईपीएससी पुनर्प्रोग्रामिंग के लिए वायरल ट्रांसडक्शन के लिए एक उपयुक्त सेल नंबर महत्वपूर्ण है। पीबीएमसी की सेल संख्या, संक्रमण की बहुलता (एमओआई) और वायरस के टाइटर पर विचार किया जाना चाहिए और इष्टतम लेनदेन परिणामों तक पहुंचने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। हृदय भेदभाव के लिए, प्रारंभिक सीडिंग घनत्व आईपीएससी के लिए महत्वपूर्ण है जिस दिन 90% से अधिक तक पहुंचने के लिए जब CHIR99021 प्रशासित किया जाता है। एक तरफ, यदि हृदय भेदभाव के समय आईपीएससी कम संकुचित हैं, तो CHIR99021 विषाक्त होगा और पर्याप्त सेल मौत का कारण बनेगा। दूसरी ओर, यदि आईपीएससी अधिक संकुचित हैं, तो उन्हें सहज भेदभाव से गुजरना होगा जो निर्देशित हृदय भेदभाव की दक्षता से समझौता करेगा । प्रारंभिक आईपीएससी-सीएम के विस्तार के लिए, समय और कार्डियोमायोसाइट गुणवत्ता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। प्रारंभिक आईपीएससी-सीएम मजबूती से तभी गुणा कर सकते हैं जब कार्डियोमायोसाइट्स की शुद्धता काफी अधिक हो। संस्कृति में मौजूदा गैर-कार्डियोमायोसाइट्स भी CHIR99021 उपचार के जवाब में पैदा हो सकते हैं, जो प्रारंभिक आईपीएससी-सीएम के प्रसार को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा। इसके अलावा, यह भेदभाव के दिन 20 से कार्डियोमायोसाइट विस्तार को प्रोत्साहित करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक बार आईपीएससी-सीएम 30 दिन से अधिक गुजर जाते हैं, तो उनके लिए मजबूत विभाजन फिर से शुरू करना मुश्किल हो जाएगा ।

मानव आईपीएससी शुरू में रेट्रोवायरस-मध्यस्थता ट्रांसफैक्शन1, 2के माध्यम से डर्मल और फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्तकिएगए थे। इन पुनर्प्रोग्रामिंग विधियों के साथ दो प्रमुख मुद्दे हैं जो रोगी आईपीएससी के नैदानिक अनुवाद में प्रगति को रोकते हैं: 1) रेट्रोवायरस मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है इस प्रकार संभावित आनुवंशिक उत्परिवर्तन शुरू होता है; 2) रोगी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट को त्वचा बायोप्सी की आवश्यकता होती है जो कई रोगियों को कम हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो रोगी आईपीएससी को मजबूती से प्राप्त करने के लिए वाणिज्यिक गैर-एकीकरण सेंडाइ वायरस23 और पीबीएमसी का उपयोग करता है। ये आईपीएससी एक्सोजेनस रिप्रोग्रामिंग वैक्टर से मुक्त हैं और अनिश्चित काल तक आत्म-नवीकरण और pluripotency के साथ बनाए रखा जा सकता है। इसके अलावा क्लीनिकल लेबोरेटरी में मरीज के खून के नमूने आसानी से एकत्र किए जाते हैं। हमारा प्रोटोकॉल बहुमुखी है और बड़े पैमाने पर भंडार और नैदानिक अनुवाद24के लिए रोगी और रोग-विशिष्ट आईपीएससी के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

मानव आईपीएससी से हृदय विभेदन के दौरान विशिष्ट सिग्नलिंग रास्तों के अनुक्रमिक मॉड्यूलेशन द्वारा मजबूत कार्डियोमायोसाइट विभेदन प्राप्त किया जाता है। कार्डियक स्पेसिफिकेशन और प्रसार में शामिल प्रमुख रास्तों में डब्ल्यूएनटी, बीएमपी, एक्टिविन, नॉच, वीजीएफ और रेटिनोइक एसिड (आरए) 10,12शामिल हैं । यहां हम छोटे रसायनों द्वारा डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के अनुक्रमिक मॉड्यूलेशन द्वारा एक कुशल हृदय विभेदन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं: पहले CHIR99021 द्वारा सक्रियण और फिर आईडब्ल्यूआर-113, 14द्वारा अवरोध। छोटे रसायन स्थिर होते हैं और विकास कारकों का उपयोग करने वालों की तुलना में लगातार भेदभाव परिणाम देते हैं। इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न अधिकांश आईपीएससी-सीएम वेंट्रिकुलर जैसे कार्डियोमायोसाइट्स हैं, जो एट्रियल और नोडल जैसी कोशिकाओं के साथ मिश्रित होते हैं। उपप्रकार-विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स की सटीक पीढ़ी ठीक ट्यूनिंग बाद में भेदभाव चरण10,12के माध्यम से प्राप्त की जाती है। उदाहरण के लिए, आईडब्ल्यूआर-1 उपचार के तुरंत बाद आरए के अलावा एट्रियल जैसे कार्डियोमायोसाइट्स का उच्च प्रतिशत होता है जबकि आरए अवरोध वेंट्रिकुलर जैसे आईपीएससी-सीएम18,22की पीढ़ी को बढ़ावा देता है। भेदभाव के बाद के चरण में WNT सिग्नलिंग सक्रियण कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं को नोडल-जैसे कार्डियोमायोसाइट्स19,21में शामिल करने को बढ़ावा देता है, जो रोगी-विशिष्ट जैविक पेसमेकर कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए आशाजनक है।

मानव आईपीएससी-सीएम अपरिपक्व हैं और सीमित प्रसार क्षमता25है । भ्रूणीय हृदय विकास के दौरान, परिपक्वता आय जबकि प्रसार घटता है। एक संकीर्ण खिड़की है जब आईपीएससी-सीएम को मजबूत प्रसार के लिए उत्तेजित किया जा सकता है, जो भ्रूणीय कार्डियोमायोसाइट विस्तार को प्रतिबिंबित करता है। यहां हम सीमित अवधि के लिए प्रारंभिक आईपीएससी-सीएम के प्रसार को बढ़ावा देने के लिए एक WNT एक्टिवेटर CHIR99021 का उपयोग करते हैं, जो हाल ही में एक रिपोर्ट17के अनुरूप है। यह अनुमान लगाया गया है कि डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग कार्डियोमायोसाइट प्रसार को संभवतः क्रॉसटॉक के माध्यम से प्रभावित करता है जिसमें पायदान और हिप्पो26,27जैसे कई अपस्ट्रीम मार्ग होते हैं । पायदान सिग्नलिंग कार्डियोमायोसाइट प्रसार को बढ़ावा देता है जबकि हिप्पो मार्ग हृदय के विकास और हृदय के आकारको 28,29,30तक सीमित करता है । यह अभी भी अज्ञात है कि कैसे पायदान और हिप्पो के बीच बातचीत डाउनस्ट्रीम Wnt गतिविधि और ठीक धुनों हृदय प्रसार की एक उपयुक्त डिग्री निर्धारित करता है । हमारे प्रोटोकॉल ने जन्मजात हृदय दोषों के रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए कार्डियोमायोसाइट प्रसार के लिए एक दिलचस्प मॉडल प्रदान किया है जो वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के हाइपोप्लासिया के कारण होते हैं, जैसे हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम (एचएलएचएस) और पल्मोनरी अट्रेसिया बरकरार वेंट्रिकुलर सेप्टम (पीए-आईवीएस) के साथ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (एएचए) कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड 18CDA34110293 (एम-टी जेड), अतिरिक्त वेंचर्स एवीआईएफ और एसवीआरएफ पुरस्कार (एम-जेड), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH/NHLBI) अनुदान 1R01HL124245 द्वारा समर्थित किया गया था, 1R01HL132520 और R01HL096962 (I.D.) । डॉ मिंग-ताओ झाओ को राष्ट्रव्यापी बाल अस्पताल में अबीगैल वेक्सनर रिसर्च इंस्टीट्यूट से स्टार्टअप फंड्स ने भी सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 168 परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं पीबीएमसी मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल आईपीएससी कार्डियक विभेदन आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग कार्डियोमायोसाइट विस्तार।
रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से मानव कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन और विस्तार
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Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

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