Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris
Summary
Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 20161, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules RPE de souris, qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. La procédure dure environ 3 heures.
Abstract
Les troubles oculaires affectent des millions de personnes dans le monde, mais la disponibilité limitée des tissus humains entrave leur étude. Les modèles murins sont des outils puissants pour comprendre la pathophysiologie des maladies oculaires en raison de leurs similitudes avec l’anatomie et la physiologie humaines. Les altérations de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), y compris les changements de morphologie et de fonction, sont des caractéristiques communes partagées par de nombreux troubles oculaires. Cependant, l’isolement et la culture réussis des cellules primaires de RPE de souris sont très provocants. Cet article est une version audiovisuelle mise à jour du protocole précédemment publié par Fernandez-Godino et coll. en 2016 pour isoler et culture efficacement les cellules primaires de l’EPR de souris. Cette méthode est hautement reproductible et se traduit par des cultures robustes de monomères RPE fortement polarisés et pigmentés qui peuvent être maintenus pendant plusieurs semaines sur Transwells. Ce modèle ouvre de nouvelles voies pour l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux maladies oculaires. En outre, il fournit une plate-forme pour tester des approches thérapeutiques qui peuvent être utilisées pour traiter les maladies oculaires importantes avec des besoins médicaux non satisfaits, y compris les troubles rétiniens héréditaires et les dégénérescences maculaires.
Introduction
Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 20161, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules d’épithélium rétinien de pigment de souris (RPE), qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. Le RPE est un monocouche situé dans l’œil entre la rétine neurale et la membrane du Bruch. Cette seule couche se compose de cellules épithéliales fortement polarisées et pigmentées reliées par des jonctions serrées, présentant une forme hexagonale qui ressemble à un nidd’abeilles 2. Malgré cette apparente simplicité histologique, le RPE remplit une grande variété de fonctions critiques pour la rétine et le cycle visuel normal2,3,4. Les fonctions principales du monocouche rpe incluent l’absorption de lumière, l’alimentation et le renouvellement des photorécepteurs, l’enlèvement des produits finaux métaboliques, le contrôle de l’homéostasie irationnelle dans l’espace subretinal et le maintien de la barrière hémato-rétinienne2,3. L’EPR a également un rôle important dans la modulation locale du système immunitaire dansl’œil 5,6,7,8,9,10,11. La dégénérescence et/ou le dysfonctionnement de l’EPR sont des caractéristiques communes partagées par de nombreux troubles oculaires tels que la rétinite pigmentaire, l’amaurose congénitale de Leber, l’albinisme, la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire12,13,14,15. Malheureusement, la disponibilité des tissus humains est limitée. Compte tenu de leur homologie génétique très conservée avec les humains, les modèles muraux représentent un outil approprié et utile pour étudier les troublesoculaires 16,17,18,19. En outre, l’utilisation de cellules primaires d’EPR cultivés offre des avantages tels que la manipulation génétique et le dépistage des drogues qui peuvent accélérer le développement de nouvelles thérapies pour ces troubles potentiellement menaçant la vision9,11.
Les méthodes existantes disponibles pour l’isolement et la culture rpe souris manquent reproductiblement et ne récapitulent pas les caractéristiques rpe in vivo avec suffisamment de fiabilité. Les cellules ont tendance à perdre la pigmentation, la forme hexagonale et la résistance électrique transepithelial (TER) en quelques jours dans la culture13,20. Depuis l’établissement de ces cultures primaires de cellules RPE à partir de souris est un processus difficile, ce protocole optimisé a été créé sur la base d’autres protocoles pour isoler les cellules RPE des yeux de ratet humains 21,22,23 pour disséquer les yeux de souris, recueillir l’EPR et la culture des cellules RPE souris in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que plusieurs méthodes d’isolement cellulaire et de culture de l’EPR de souris avaient étédéveloppées avant 1,13,20,22,26,27, la méthode fernandez-Godino a d’abord utilisé des inserts membranaires permettant la croissance efficace des cellules RPE en culture pendant les semaines1<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par l’Ocular Genomics Institute du Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
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