Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü
Summary
İlk olarak 20161’deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.
Abstract
Göz bozuklukları dünya çapında milyonlarca insanı etkiler, ancak insan dokularının sınırlı mevcudiyeti çalışmalarını engeller. Fare modelleri, insan anatomisi ve fizyolojisi ile benzerlikleri nedeniyle oküler hastalıkların patofizyolojisini anlamak için güçlü araçlardır. Morfoloji ve fonksiyon değişiklikleri de dahil olmak üzere retina pigment epitelindeki (RPE) değişiklikler, birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan yaygın özelliklerdir. Bununla birlikte, birincil fare RPE hücrelerinin başarılı izolasyonu ve kültürü çok zordur. Bu makale, birincil fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için daha önce Fernandez-Godino ve arkadaşları tarafından 2016’da yayınlanan protokolün güncellenmiş bir görsel-işitsel sürümüdür. Bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve Transwells’te birkaç hafta boyunca sürdürülebilen yüksek polarize ve pigmentli RPE monolayerlerinin sağlam kültürleriyle sonuçlanır. Bu model, göz hastalıklarının altında kalan moleküler ve hücresel mekanizmaların incelenmesi için yeni yollar açmaktadır. Ayrıca, kalıtsal retina bozuklukları ve makula dejenerasyonları da dahil olmak üzere karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları olan önemli göz hastalıklarını tedavi etmek için kullanılabilecek terapötik yaklaşımları test etmek için bir platform sağlar.
Introduction
İlk olarak 20161’deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde fonksiyonel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare retina pigment epitel (RPE) hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntemi açıklar. RPE, nöral retina ile Bruch zarı arasında bulunan bir monolayerdir. Bu tek katman, bir petek2’yebenzeyen altıgen bir şekil sergileyen sıkı kavşaklarla birleştirilen son derece polarize ve pigmentli epitel hücrelerinden oluşur. Bu belirgin histolojik basitliğe rağmen, RPE retina ve normal görme döngüsü 2 ,3,4için kritik olan çok çeşitli işlevleri yerine getirir. RPE monolayer’ın ana işlevleri arasında ışık emilimi, fotoreceptörlerin beslenmesi ve yenilenmesi, metabolik uç ürünlerin çıkarılması, altretinal alanda iyon homeostazının kontrolü ve kan-retina bariyerinin bakımı2,3. RPE ayrıca göz 5 , 6 ,7,8,9,10,11bağışıklık sisteminin lokal modülasyonunda önemli bir role sahiptir. RPE’nin dejenerasyonu ve/veya işlev bozukluğu, retinitis pigmentosa, Leber konjenital amaurosis, albinizm, diyabetik retinopati ve makula dejenerasyonu12 , 13,14,15gibi birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan yaygın özelliklerdir. Ne yazık ki, insan dokularının mevcudiyeti sınırlıdır. İnsanlarla yüksek oranda korunmuş genetik homolojileri göz önüne alındığında, fare modelleri oküler bozuklukları incelemek için uygun ve yararlı bir aracı temsil eder16,17,18,19. Ayrıca, kültürlü birincil RPE hücrelerinin kullanımı, bu görme tehdit eden bozukluklar için yeni tedavilerin gelişimini hızlandırabilecek genetik manipülasyon ve ilaç testi gibi avantajlar sağlar9,11.
Fare RPE yalıtımı ve kültürü için mevcut yöntemler tekrarlanabilir bir şekilde eksiktir ve RPE özelliklerini in vivo olarak yeterli güvenilirlikle yeniden yakalamaz. Hücreler pigmentasyon, altıgen şekil ve transepithelial elektrik direncini (TER) kültürde birkaç gün içinde kaybetme eğilimindedir13,20. Bu birincil RPE hücre kültürlerini farelerden oluşturmak zor bir süreç olduğundan, bu optimize edilmiş protokol, fare gözlerini parçalamak, RPE’yi toplamak ve fareRPEhücrelerini in vitro olarak kültüre etmek içinRPE hücrelerini sıçan ve insan gözlerinden izole etmek için diğer protokollere dayanarak oluşturulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fare RPE hücre izolasyonu ve kültürü için çeşitli yöntemler 1 ,13,20,22,26,27‘ den önce geliştirilmişken, Fernandez-Godino’nun yöntemi ilk olarak RPE hücrelerinin kültürde haftalarca verimli büyümesine izin sağlayan membran kesici uçları kullandı1,9.</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Massachusetts Eye and Ear’deki Oküler Genomik Enstitüsü tarafından desteklendi.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch’s membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
