ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי
Summary
פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח ‘. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.
Abstract
הפרעות עיניים משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם, אבל הזמינות המוגבלת של רקמות אנושיות מעכבת את המחקר שלהם. מודלים עכבר הם כלים רבי עוצמה כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות עיניים בגלל הדמיון שלהם עם אנטומיה אנושית ופיזיולוגיה. שינויים באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), כולל שינויים במורפולוגיה ובתפקוד, הם תכונות נפוצות המשותפות להפרעות עיניים רבות. עם זאת, בידוד ותרבות מוצלחים של תאי RPE של העכבר הראשי הוא מאתגר מאוד. מאמר זה הוא גרסה אורקולית מעודכנת של הפרוטוקול שפורסם בעבר על ידי פרננדז-Godino ואח ‘. בשנת 2016 כדי לבודד ביעילות ותרבות תאי RPE העכבר הראשי. שיטה זו היא מאוד לשחזור ותוצאות תרבויות חזקות של מונוליירים RPE מקוטב מאוד פיגמנטים שניתן לשמור במשך מספר שבועות על Transwells. מודל זה פותח אפיקים חדשים לחקר המנגנונים המולקולריים והתאית שבבסיס מחלות עיניים. יתר על כן, הוא מספק פלטפורמה לבדיקת גישות טיפוליות שניתן להשתמש בהן לטיפול במחלות עיניים חשובות עם צרכים רפואיים בלתי פוסקים, כולל הפרעות רשתית תורשתיות וניוונות מקולריים.
Introduction
פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח ‘. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות עכבר רשתית פיגמנט תאים (RPE), אשר יוצרים מונולאייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על צלחות Transwell. RPE הוא מונולייר הממוקם בעין בין הרשתית העצבית לקרום של ברוך. שכבה אחת זו מורכבת מתאי אפיתל מקוטבים ופיגמנטיים מאוד אליהם מצטרפים צמתים הדוקים, המציגים צורה משושה הדומה חלת דבש2. למרות הפשטות ההיסטולוגית לכאורה, RPE מבצע מגוון רחב של פונקציות קריטיות הרשתית ואת מחזור הראייה הרגיל2,3,4. הפונקציות העיקריות של המונולאייר RPE כוללות ספיגת אור, הזנה וחידוש של פוטורצפטורים, הסרת מוצרי קצה מטבוליים, שליטה על הומאוסטזיס יון בחלל subretinal ותחזוקה של מחסום רשתית הדם2,3. RPE יש גם תפקיד חשוב אפנון מקומי של המערכת החיסונית בעין5,6,7,8,9,10,11. ניוון ו/או תפקוד לקוי של RPE הם תכונות נפוצות המשותפות להפרעות עיניים רבות כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, לאבר אמורוזיס מולד, לבקנות, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי12,13,14,15. למרבה הצער, הזמינות של רקמות אנושיות מוגבלת. בהתחשב בהומולוגיה הגנטית השמורה ביותר שלהם עם בני אדם, מודלים של עכברים מייצגים כלי מתאים ושימושי לחקר הפרעות עיניים16,17,18,19. יתר על כן, השימוש בתאי RPE ראשוניים תרבותיים מספק יתרונות כגון מניפולציה גנטית ובדיקות סמים שיכולים להאיץ את הפיתוח של טיפולים חדשים עבור הפרעות אלה מאיים ראייה9,11.
שיטות קיימות הזמינות עבור בידוד RPE העכבר ותרבות חסרים לשכפל ולא לשחזר את תכונות RPE ב vivo עם אמינות מספיק. תאים נוטים לאבד פיגמנטציה, צורה משושה והתנגדות חשמלית transepithelial (TER) בתוך כמה ימים בתרבות13,20. מאז הקמת אלה תרביות תא RPE העיקרי מעכברים הוא תהליך מאתגר, פרוטוקול זה אופטימיזציה נוצרה בהתבסס על פרוטוקולים אחרים כדי לבודד תאי RPE מחולשה ועיניים אנושיות21,22,23 כדי לנתח את עיני העכבר, לאסוף את RPE ותרבות תאי RPE העכבר במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד מספר שיטות עבור העכבר RPE בידוד ותרבות התאים פותחו לפני1,13,20,22,26,27, השיטה של פרננדז-גודינו השתמשה לראשונה מוסיף ממברנה המאפשר צמיחה יעילה של תאי RPE בתרבות במשך שבועות1</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכון גנומיקה עינית במסצ’וסטס עין ואוזן.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch’s membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
