Эффективное рассечение и культура первичной мыши сетчатки Пигмент эпителиальных клеток
Summary
Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016году 1, описывает метод эффективной изоляции и культуры мыши RPE клетки, которые образуют функциональные и поляризованные RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. Процедура занимает около 3 часов.
Abstract
Нарушения глаз затрагивают миллионы людей во всем мире, но ограниченная доступность тканей человека препятствует их изучению. Мыши модели являются мощными инструментами для понимания патофизиологии глазных заболеваний из-за их сходства с анатомией человека и физиологии. Изменения в эпителии пигмента сетчатки (RPE), включая изменения в морфологии и функции, являются общими чертами, разделяемыми многими глазными расстройствами. Тем не менее, успешная изоляция и культура первичных клеток RPE мыши является очень сложной задачей. Данный документ представляет 100-ю аудиовизуальную версию протокола, ранее опубликованного Фернандесом-Годино и др. в 2016 году для эффективной изоляции и культуры первичных ячеек мыши RPE. Этот метод является весьма воспроизводимым и приводит к надежной культуры сильно поляризованных и пигментированных rpE монослой, которые могут быть сохранены в течение нескольких недель на Transwells. Эта модель открывает новые возможности для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе заболеваний глаз. Кроме того, он предоставляет платформу для тестирования терапевтических подходов, которые могут быть использованы для лечения важных глазных заболеваний с неудовлетворенными медицинскими потребностями, включая наследственные расстройства сетчатки и макулярную дегенерацию.
Introduction
Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016году 1, описывает метод эффективно изолировать и культуры мыши сетчатки пигмент эпителия (RPE) клетки, которые образуют функциональный и поляризованный RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. RPE является монослой, расположенный в глазу между нервной сетчаткой и мембраной Бруха. Этот один слой состоит из сильно поляризованных и пигментированных эпителиальных клеток, к ним присоединяются плотные соединения, проявляли шестиугольную форму, напоминающуюсоты 2. Несмотря на эту кажущуюся гистологическую простоту, RPE выполняет широкий спектр функций, критически важных для сетчатки и нормальногозрительного цикла 2,3,4. Основными функциями монослой RPE являются поглощение света, питание и обновление фоторецепторов, удаление метаболических конечных продуктов, контроль ионного гомеостаза в подретинном пространстве и поддержание гемеконефалическогобарьера 2,3. RPE также играет важную роль в локальной модуляции иммуннойсистемы в глаза 5,6,7,8,9,10,11. Дегенерация и / или дисфункции RPE являются общими чертами разделяют многие глазные расстройства, такие как пигментный ретинит, Лебер врожденный амауроз, альбинизм, диабетическая ретинопатия, имакулярной дегенерации 12,13,14,15. К сожалению, доступность тканей человека ограничена. Учитывая их высоко сохранившейся генетической гомологии с людьми, мыши модели представляют собой подходящий и полезный инструмент для изучения глазных расстройств16,17,18,19. Кроме того, использование культурных первичных клеток RPE обеспечивает такие преимущества, как генетические манипуляции и тестирование на наркотики, которые могут ускорить разработку новыхметодов лечения этих опасных для зрения расстройств 9,11.
Существующие методы, доступные для изоляции мыши RPE и культуры, не воспроизводимы и не подысовыв RPE-функции in vivo с достаточной надежностью. Клетки, как правило, теряют пигментацию, шестиугольную форму и трансепителиальное электрическое сопротивление (TER) в течение несколькихдней в культуре 13,20. Поскольку создание этих основных культур rpE клеток от мышей является сложным процессом, этот оптимизированный протокол был создан на основе других протоколов, чтобы изолировать клетки RPE открыс и человеческих глаз 21,22,23, чтобы вскрыть глаза мыши, собирать RPE и культуры мыши RPE клеток в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя несколько методов для мыши RPE изоляции клетоки культуры были разработаны до 1,13,20,22,26,27, Фернандес-Годино метод впервые используется мембрана вставки позволяет эффективного ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Институтом глазной геномики в Массачусетсе глаз и ушей.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch’s membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
