Effektiv disseksjon og kultur av primære mus retinal pigment epitelceller
Summary
Denne protokollen, som opprinnelig ble rapportert av Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode for effektivt å isolere og kulturmus RPE-celler, som danner en funksjonell og polarisert RPE monolayer innen en uke på Transwell-plater. Prosedyren tar ca. 3 timer.
Abstract
Øyesykdommer påvirker millioner av mennesker over hele verden, men den begrensede tilgjengeligheten av humant vev hindrer studien deres. Musemodeller er kraftige verktøy for å forstå patofysiologien til okulære sykdommer på grunn av deres likheter med menneskelig anatomi og fysiologi. Endringer i retinal pigment epitel (RPE), inkludert endringer i morfologi og funksjon, er vanlige funksjoner som deles av mange okulære lidelser. Imidlertid er vellykket isolasjon og kultur av primære mus RPE-celler svært utfordrende. Denne artikkelen er en oppdatert audiovisuell versjon av protokollen som tidligere ble publisert av Fernandez-Godino et al. i 2016 for effektivt å isolere og dyrke primære mus RPE-celler. Denne metoden er svært reproduserbar og resulterer i robuste kulturer av svært polariserte og pigmenterte RPE monolayers som kan opprettholdes i flere uker på Transwells. Denne modellen åpner nye veier for studiet av molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for øyesykdommer. Videre gir det en plattform for å teste terapeutiske tilnærminger som kan brukes til å behandle viktige øyesykdommer med udekkede medisinske behov, inkludert arvelige netthinneforstyrrelser og makuladegenerasjoner.
Introduction
Denne protokollen, som opprinnelig ble rapportert av Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode for effektivt å isolere og kultur mus retinal pigment epitel (RPE) celler, som danner en funksjonell og polarisert RPE monolayer innen en uke på Transwell plater. RPE er en monolayer som ligger i øyet mellom nevral netthinnen og Bruchs membran. Dette enkeltlaget består av svært polariserte og pigmenterte epitelceller forbundet med tette veikryss, og viser en sekskantet form som ligner en honningkake2. Til tross for denne tilsynelatende histologiske enkelheten, utfører RPE et bredt spekter av funksjoner som er kritiske for netthinnen og den normale visuelle syklusen2,3,4. Hovedfunksjonene til RPE monolayer inkluderer lysabsorpsjon, næring og fornyelse av fotoreseptorer, fjerning av metabolske sluttprodukter, kontroll av ion homeostase i subretinal plass og vedlikehold av blod-retinal barriere2,3. RPE har også en viktig rolle i lokal modulering av immunsystemet i øyet5,6,7,8,9,10,11. Degenerasjon og/eller dysfunksjon av RPE er vanlige trekk som deles av mange okulære lidelser som retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose, albinisme, diabetisk retinopati og makuladegenerasjon12,13,14,15. Dessverre er tilgjengeligheten av menneskelig vev begrenset. Gitt deres høyt bevarte genetiske homologi med mennesker, representerer musemodeller et passende og nyttig verktøy for å studere okulære lidelser16,17,18,19. Videre gir bruk av kultiverte primære RPE-celler fordeler som genetisk manipulasjon og legemiddeltesting som kan akselerere utviklingen av nye terapier for disse synstruende lidelsene9,11.
Eksisterende metoder tilgjengelig for mus RPE isolasjon og kultur mangler reprodusert og ikke rekapitulere RPE funksjoner in vivo med nok pålitelighet. Celler har en tendens til å miste pigmentering, sekskantet form og transepithelial elektrisk motstand (TER) innen få dager i kultur13,20. Siden etableringen av disse primære RPE-cellekulturene fra mus er en utfordrende prosess, er denne optimaliserte protokollen opprettet basert på andre protokoller for å isolere RPE-celler fra rotte og menneskelige øyne21,22,23 for å dissekere museøyne, samle RPE og kultur musen RPE celler in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens flere metoder for mus RPE celleisolasjon og kultur hadde blitt utviklet før1,13,20,22,26,27, Fernandez-Godino metode først brukt membran innsatser slik at effektiv vekst av RPE celler i kultur i uke1,9. En annen stor endring i deres protokoll1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Ocular Genomics Institute ved Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch’s membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
