シロイヌナズナなどのうどんこ病感染表現型を正確に評価するための簡便かつ柔軟な接種法
Summary
~50 μmメッシュの接種ボックスと透明なプラスチックチャンバーからなる簡単な胞子分布システムを構築するためのプロトコルを提示します。これにより、うどんこ病胞子を植物に均一に接種できるため、研究中の植物の病害表現型を正確かつ再現性よく評価できます。
Abstract
真菌病による作物の損失を減らすには、植物の免疫と真菌の病因を支配するメカニズムの理解を深める必要があり、特定の真菌病原体に感染したときの植物の病気の表現型を正確に決定する必要があります。しかし、うどんこ病などの培養不可能な生物栄養性真菌病原体による正確な疾患表現型は、達成が容易ではなく、研究プロジェクトの律速ステップになる可能性があります。ここでは、シロイヌナズナとうどんこ病の相互作用を例に、安全で効率的で操作しやすい疾患表現型システムを開発しました。このシステムは主に3つのコンポーネントで構成されています:(i)真菌胞子を植物のフラットに接種するための~50μmの細孔のステンレス鋼またはナイロンメッシュに取り付けられた取り外し可能な蓋を備えた木製の接種ボックス、(ii)内部で接種を行いながら胞子の脱出を最小限に抑えるための小さな前面開口部を備えた透明なプラスチックチャンバー。 (iii)均一かつ効果的な接種のための胞子の脱落および分布方法。 ここで説明するプロトコルには、接種ボックスとプラスチックチャンバーを低コストで作成するための手順とパラメーター、およびシステムを使用してうどんこ病胞子を均一に接種できるようにし、病気の表現型の精度と再現性を向上させる方法のビデオデモンストレーションが含まれています。
Introduction
うどんこ病は、多くの食用作物や観賞用植物の最も一般的で重要な病気の1つです1。うどんこ病の研究は非常に人気があり、Web of Scienceでは「うどんこ病」をキーワードにした検索結果として10,500件以上の出版物が掲載されています(2020年11月現在)。確かに、うどんこ病(Blumeria graminisに代表される)は、Molecular Plant Pathology2のジャーナルによってトップ10の真菌病原体の1つと考えられています。病害感受性の定量化は、病害抵抗性または感受性に寄与する植物遺伝子の特性評価、またはうどんこ病における候補エフェクター遺伝子の機能同定に必要なステップです。しかし、うどんこ病の胞子とは異なり、うどんこ病種の胞子(私たちの研究室での経験に基づくGolovinomyces cichoracearum UCSC1など)は、水懸濁プロセスを経た後、生存率の低下を示すため、他のほとんどの真菌性病原体と比較して、信頼性の高い病気の表現型ははるかに困難です3,4.特定のうどんこ病病原体を試験植物に不適切および/または不均一に接種すると、表現型の結果が不正確になる可能性があります。
うどんこ病の研究では、多くの接種方法が報告されています。これらには、(i)感染した葉から試験植物5への胞子のブラッシング、(ii)試験植物6への胞子懸濁液の噴霧、(iii)塔7の下部にある植物への真空作動沈殿塔を使用した胞子の吹き付け、および(iv)ナイロンメッシュ膜と音ベースの振動の組み合わせ使用による胞子送達8.胞子ブラッシング(またはダスティング)法は、実行は簡単ですが、本質的に不均一であるため、定量的評価には正確ではない場合があります。胞子散布は便利で均一ですが、上記のように胞子の発芽が悪くなる可能性があります4。後者の2つ(すなわち、iii-iv)は、均一な接種を達成することができるはるかに改良された方法である。しかし、どちらも1回のイベントで接種する植物の数に関して接種能力を調整するのに柔軟性がなく、どちらの装置も自明ではなく、操作は真空および/または電源がある実験室エリアに限定されます。
私たちの研究室は、20年以上にわたって植物とうどんこ病の相互作用に取り組んできました9,10。過去10年間、私たちは多くの接種方法をテストし、最近、シンプルで効果的なうどんこ病接種方法を開発しました。このメッシュベースの胞子ブラッシング法は、均一な接種を保証することができ、シンプルでスケーラブルであるため、うどんこ病を扱うすべての研究室で簡単に採用できるはずです。
Protocol
Representative Results
Discussion
メッシュボックスベースの接種方法は、他の接種方法に比べていくつかの利点があります。まず、 図5に示すように、適切に操作すれば胞子の均一な分布を実現できます。第二に、~50μmのメッシュの使用に加えて、感染した葉の穏やかな振とうによる胞子除去は、ソース植物に存在するアザミウマまたは他の植物感染昆虫による植物感染を減らすことができます。第三?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団(IOS-1901566)によってS.シャオに支援されました。著者らは、植物成長施設のメンテナンスについてF.コーカーとC.フックス、および接種ボックスとチャンバーの製造に関連する技術的支援を提供してくれたホルヘサモラに感謝したいと思います。
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
