애기장대 및 기타 식물의 흰가루병 감염 표현형을 정확하게 평가하기 위한 쉽고 유연한 접종 방법
Summary
우리는 ~ 50 μm 메쉬가있는 접종 상자와 투명한 플라스틱 챔버로 구성된 간단한 포자 분배 시스템을 구성하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 식물에 흰가루병 포자를 고르게 접종하는 데 사용할 수 있으므로 연구 중인 식물의 질병 표현형을 정확하고 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.
Abstract
곰팡이 질병으로 인한 작물 손실을 줄이려면 식물 면역 및 곰팡이 발병 기전을 관리하는 메커니즘에 대한 이해가 향상되어야하며, 이는 특정 곰팡이 병원균에 감염되었을 때 식물의 질병 표현형을 정확하게 결정해야합니다. 그러나 흰가루병과 같은 배양 불가능한 생물 영양 곰팡이 병원체를 사용한 정확한 질병 표현형은 달성하기 쉽지 않으며 연구 프로젝트의 속도 제한 단계가 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 Arabidopsis-흰가루병 상호 작용을 예로 사용하여 안전하고 효율적이며 작동하기 쉬운 질병 표현형 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 주로 세 가지 구성 요소로 구성됩니다 : (i) 곰팡이 포자가있는 식물의 평평한 부분을 접종하기위한 ~ 50 μm 기공의 스테인레스 스틸 또는 나일론 메쉬가 장착 된 탈착식 뚜껑이 장착 된 목재 접종 상자, (ii) 내부에 접종을 수행하는 동안 포자 탈출을 최소화하기위한 작은 전면 개구부가있는 투명한 플라스틱 챔버, 및 (iii) 균일하고 효과적인 접종을 위한 포자 제거 및 분배 방법. 여기에 설명된 프로토콜에는 접종 상자와 플라스틱 챔버를 저렴한 비용으로 만들기 위한 단계 및 매개변수, 그리고 시스템을 사용하여 흰가루병 포자를 균일하게 접종하여 질병 표현형의 정확성과 재현성을 개선하는 방법에 대한 비디오 데모가 포함됩니다.
Introduction
흰가루병은 수많은 식량 작물과 관상용 식물1의 가장 흔하고 중요한 질병 중 하나입니다. 흰가루병에 대한 연구는 Web of Science(2020년 11월 기준)에서 “흰가루병”을 키워드로 한 검색 결과로 10,500개 이상의 출판물에서 알 수 있듯이 매우 인기가 있습니다. 실제로, 흰가루병 (Blumeria graminis로 대표)은 분자 식물 병리학저널 2에 의해 상위 10 개 곰팡이 병원체 중 하나로 간주됩니다. 질병 감수성의 정량화는 질병 저항성 또는 감수성에 기여하는 식물 유전자의 특성화 또는 흰가루병에서 후보 효과기 유전자의 기능적 식별에 필요한 단계입니다. 그러나 신뢰할 수 있는 질병 표현형은 대부분의 다른 곰팡이 병원균에 비해 흰가루병에서 훨씬 더 까다로운데, 부분적으로는 후자의 포자와 달리 흰가루병 종의 포자(예: 실험실 경험을 기반으로 한 Golovinomyces cichoracearum UCSC1)는 물 현탁 과정을 거친 후 생존력이 감소한 것으로 나타남 3,4 . 특정 흰가루병 병원체가 있는 시험 식물의 부적절하거나 고르지 않은 접종은 부정확한 표현형 결과를 초래할 수 있습니다.
흰가루병 연구에 대해 여러 접종 방법이 보고되었습니다. 여기에는 (i) 감염된 잎에서 시험 식물로 직접 포자를 솔질하는 것(5), (ii) 포자 현탁액을 시험 식물6에 분무하는것, (iii) 진공 작동식 침전탑을 사용하여 포자를 타워바닥에 있는 식물에 불어넣기(7) 및 (iv) 나일론 메쉬 멤브레인과소리 기반 진동8을 조합하여 포자 전달 . 포자 브러싱 (또는 먼지 제거) 방법은 수행하기 쉽지만 본질적으로 고르지 않으므로 정량적 평가에는 정확하지 않을 수 있습니다. 포자 살포는 편리하고 균일하지만 위에서 언급했듯이 포자 발아가 불량할 수 있습니다4. 후자의 두 가지 (즉, iii-iv)는 균일 한 접종을 달성 할 수있는 훨씬 개선 된 방법입니다. 그러나 둘 다 단일 이벤트에서 접종할 식물의 수 측면에서 접종 용량을 조정하는 데 유연하지 않아 두 장치 중 하나가 사소한 것이 아니며 진공 및/또는 전원이 있는 실험실 영역으로 작동이 제한됩니다.
우리 실험실은 20 년 넘게 식물-분말 곰팡이 상호 작용을 연구 해 왔습니다 9,10. 지난 10 년 동안 우리는 여러 접종 방법을 테스트했으며 최근에는 간단하면서도 효과적인 흰가루병 접종 방법을 개발했습니다. 이 메쉬 기반 포자 브러싱 방법은 균일한 접종을 보장할 수 있으며 간단하고 확장 가능하므로 흰가루병을 다루는 모든 실험실에서 쉽게 채택해야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
당사의 메쉬 박스 기반 접종 방법은 다른 접종 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 그림 5에서 볼 수 있듯이 적절하게 작동하면 포자의 균일한 분포를 달성할 수 있습니다. 둘째, ~ 50 μm 메쉬를 사용하고 감염된 잎을 부드럽게 흔들어 포자를 제거하면 원천 식물에 존재하는 총채벌레 또는 기타 식물 감염 곤충에 의한 식물 감염을 줄일 수 있습니다. 셋째, 플라스틱 챔…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 과학 재단 (IOS-1901566)이 S. Xiao에게 지원했습니다. 저자는 식물 성장 시설의 유지 보수에 대해 F. Coker와 C. Hooks, 접종 상자 및 챔버 제작과 관련된 기술적 도움을 준 호르헤 사모라에게 감사드립니다.
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
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