Простой и гибкий метод инокуляции для точной оценки фенотипов мучнистой росы и других растений
Summary
Представлен протокол построения простой системы распределения спор, состоящей из прививочной коробки с сеткой ~50 мкм и прозрачной пластиковой камеры. Это может быть использовано для равномерной прививки растений спорами мучнистой росы, что позволяет точно и воспроизводимо оценивать фенотипы заболеваний исследуемых растений.
Abstract
Снижение потерь урожая из-за грибковых заболеваний требует лучшего понимания механизмов, регулирующих иммунитет растений и грибковый патогенез, что, в свою очередь, требует точного определения фенотипов заболеваний растений при заражении конкретным грибковым патогеном. Тем не менее, точное фенотипирование заболевания некультурными биотрофными грибковыми патогенами, такими как мучнистая роса, нелегко достичь и может быть ограничивающим скорость шагом исследовательского проекта. Здесь мы разработали безопасную, эффективную и простую в эксплуатации систему фенотипирования заболеваний, используя в качестве примера взаимодействие арабидопсис-мучнистая роса. Эта система в основном состоит из трех компонентов: (i) деревянная прививочная коробка, оснащенная съемной крышкой, установленной с помощью нержавеющей стали или нейлоновой сетки длиной ~ 50 мкм пор для прививки плоской части растений грибковыми спорами, (ii) прозрачная пластиковая камера с небольшим передним отверстием для минимизации утечки спор при проведении инокуляции внутри, и iii) метод дифференциации и распределения спор для равномерной и эффективной прививки. Протоколы, описанные здесь, включают этапы и параметры для изготовления прививочной коробки и пластиковой камеры при низких затратах, а также видеодемонстрацию того, как использовать систему, чтобы обеспечить даже прививку спорами мучнистой росы, тем самым повышая точность и воспроизводимость фенотипирования заболевания.
Introduction
Мучнистая роса является одним из самых распространенных и важных заболеваний многочисленных продовольственных культур и декоративных растений1. Исследования болезней мучнистой росы были очень популярны, о чем свидетельствуют более 10 500 публикаций в качестве результата поиска с «мучнистой росой» в качестве ключевого слова в Web of Science (по состоянию на ноябрь 2020 года). Действительно, мучнистая роса (представленная Blumeria graminis) считается одним из 10 лучших грибковых патогенов журналом Molecular Plant Pathology2. Количественная оценка восприимчивости к болезням является необходимым шагом в характеристике генов растений, способствующих устойчивости или восприимчивости к болезням, или функциональной идентификации генов-кандидатов-эффекторов в мучнистой росе. Тем не менее, надежное фенотипирование болезней гораздо сложнее с мучнистой росой по сравнению с большинством других грибковых патогенов, отчасти потому, что, в отличие от спор последних, споры видов мучнистой росы (таких как Golovinomyces cichoracearum UCSC1 на основе нашего лабораторного опыта) показывают снижение жизнеспособности после прохождения процесса водной суспензии 3,4 . Неадекватная и/или неравномерная прививка испытуемых растений конкретным патогеном мучнистой росы может привести к неточным результатам фенотипирования.
Сообщалось о ряде методов вакцинации для исследований мучнистой росы. К ним относятся(i) расчесывание спор непосредственно из зараженных листьев для испытания растений5, (ii) распыление споровой суспензии для испытания растений6, (iii) выдувание спор с использованием вакуумной отстойной башни к растениям в нижней части башни7 и (iv) доставка спор путем комбинаторного использования нейлоновой сетчатой мембраны и звуковой вибрации8 . Метод споровой чистки (или пыления) прост в выполнении, но неравномерен по своей природе, поэтому он может быть неточным для количественной оценки. Распыление спор удобно и равномерно, но, как указано выше, может привести к плохому прорастанию спор4. Последние два (т.е. iii-iv) являются значительно улучшенными методами, способными обеспечить даже прививку; однако оба не являются гибкими в регулировке своей способности к вакцинации с точки зрения количества установок, подлежащих вакцинации в одном событии, что делает любой аппарат нетривиальным, и их работа ограничена лабораторными областями, где есть вакуум и / или источник электричества.
Наша лаборатория работает с взаимодействием растений и мучнистой росы более 20 лет 9,10. За последнее десятилетие мы протестировали ряд методов вакцинации и недавно разработали простой и в то же время эффективный метод прививки мучнистой росы. Этот метод щетки на основе сетки может обеспечить равномерную прививку и является простым и масштабируемым, поэтому должен быть легко принят любой лабораторией, работающей с мучнистой росой.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш метод инокуляции на основе сетчатой коробки имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами инокуляции. Во-первых, он может достичь равномерного распределения спор при правильной эксплуатации, как показано на рисунке 5. Во-вторых, использование сетки ~ 50 мкм, а …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана Национальным научным фондом (IOS-1901566) С. Сяо. Авторы хотели бы поблагодарить Ф. Кокера и К. Хукса за обслуживание установки для роста растений, а также Хорхе Самору за техническую помощь, связанную с изготовлением прививочной коробки и камеры.
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
