Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique
Summary
Cette étude décrit une nouvelle méthode d’isolement des adipocytes bruns murins pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines.
Abstract
Le tissu adipeux brun (MTD) est responsable de la thermogenèse non frissonnante chez les mammifères, et les adipocytes bruns (BA) sont les unités fonctionnelles des MTD. Les BA contiennent à la fois des gouttelettes lipidiques multiloculaires et des mitochondries abondantes, et ils expriment la protéine de découplage 1 (UCP1). Les BA sont classés en deux sous-types en fonction de leur origine : les BA classiques dérivés d’embryons (ABAc) et les BA dérivés d’adipocytes blancs. En raison de leur densité relativement faible, les BA ne peuvent pas être isolés des MTD avec la méthode de centrifugation traditionnelle. Dans cette étude, une nouvelle méthode a été développée pour isoler les BA de souris pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines. Dans ce protocole, les MTD interscapulaires de souris adultes ont été digérées avec une solution de collagénase et de dispase, et les BA dissociés ont été enrichis avec une solution d’iodixanol à 6%. Les BA isolés ont ensuite été lysés avec le réactif Trizol pour l’isolement simultané de l’ARN, de l’ADN et des protéines. Après isolement de l’ARN, la phase organique du lysat a été utilisée pour l’extraction des protéines. Nos données ont montré que la solution d’iodixanol à 6% enrichissait efficacement les BA sans interférer avec les études de suivi sur l’expression des gènes et des protéines. Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) est un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses. Par rapport au tissu adipeux brun, les BA isolés avaient une expression significativement plus élevée de Pdgfa. En résumé, cette nouvelle méthode fournit une plate-forme pour étudier la biologie des adipocytes bruns au niveau d’un seul type cellulaire.
Introduction
Les souris et les humains ont deux types de tissus adipeux : le tissu adipeux blanc (WAT) et le tissu adipeux brun (MTD)1. WAT stocke l’énergie sous forme de triglycérides dans les adipocytes blancs, et les adipocytes bruns (BA) de BAT dissipent l’énergie chimique sous forme de chaleur2. En fonction de leur origine développementale, les BA sont ensuite classés en BA classiques (cBA) qui se sont formés au cours du développement embryonnaire et en BA dérivés d’adipocytes blancs (cellules beiges / brite, converties à partir d’adipocytes blancs dans des conditions de stress)3. Les BA sont multiloculaires et expriment la protéine thermogénique de découplage 1 (UCP1)4. Le dépôt de MTD interscapulaire (iBAT) est l’un des principaux dépôts de cBA chez les petits mammifères5, tandis que les cellules beiges sont dispersées dans WAT6.
En raison de leur nature de dissipation de l’énergie, les BA ont reçu beaucoup d’attention en tant que cible thérapeutique pour réduire l’obésité7. Pour exploiter les BA dans le but de traiter l’obésité, il est essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la fonction, la survie et le recrutement des BA. Les tissus adipeux, y compris la MTD et la WAT, sont hétérogènes. À l’exception des adipocytes, les tissus adipeux contiennent de nombreux autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses et les macrophages8. Bien qu’il existe des outils génétiques pour épuiser spécifiquement les gènes candidats chez les souris BA, tels que UCP1::Cre line9, les techniques de purification des BAT ou WAT sont limitées, ce qui rend difficile l’étude des BA au niveau d’un type unicellulaire. De plus, sans obtenir des BA purs, la relation entre les BA et les non-BA ne sera pas clairement définie. Par exemple, le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) a été utilisé comme marqueur pour les cellules mésenchymateuses indifférenciées, et il est exprimé dans les cellules endothéliales et interstitielles de la MTD. Dans les MTD soumises à un stress froid, les cellules progénitrices PDGFRα positives donnent naissance à de nouveaux BAs10. PDGFRα est activé par son ligand PDGF, un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses11; cependant, il n’est pas clair si les BA influencent le comportement des cellules progénitrices PDGFRα positives en sécrétant PDGF.
Récemment, un protocole d’isolement des BA a été publié, basé sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)12. Dans ce protocole, une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % a été utilisée pour séparer les BA des non-BA, et les BA enrichies ont été purifiées par FACS. L’application de ce protocole est limitée par l’exigence du processus FACS, qui repose à la fois sur l’équipement et sur l’expérience d’exploitation du FACS. Dans cette étude, un nouveau protocole pour isoler les BA des MTD a été développé. Les BA isolés par ce protocole peuvent être directement utilisés pour des études d’expression génique et protéique. De plus, les données de cette étude suggèrent que les AB sont une ressource importante du FGPD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, une nouvelle méthode d’isolement des BA pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines a été développée.
Dans un protocole d’isolation BAs publié, une solution BSA à 3% a été utilisée pour enrichir les BA12. Néanmoins, les BA enrichis obtenus par ce protocole publié n’ont pas pu être directement utilisés pour l’analyse de l’expression protéique. En effet, le BSA concentré existant dans la solution de BAs inte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin a été soutenu par les fonds des National Institutes of Health HL138454-01 et du Masonic Medical Research Institute.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
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