Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica
Summary
Este estudio describe un nuevo método para aislar adipocitos marrones murinos para el análisis de expresión génica y proteica.
Abstract
El tejido adiposo marrón (BAT) es responsable de la termogénesis sin temblores en los mamíferos, y los adipocitos marrones (BA) son las unidades funcionales de BAT. Las BA contienen gotitas lipídicas multiloculares y abundantes mitocondrias, y expresan la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1). Los BA se clasifican en dos subtipos según su origen: BA clásicos derivados de embriones (cBA) y BA derivados de adipocitos blancos. Debido a su densidad relativamente baja, los BA no pueden aislarse de las MTD con el método de centrifugación tradicional. En este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar BA de ratones para el análisis de expresión génica y proteica. En este protocolo, el BAT interescapular de ratones adultos se digirió con solución de colagenasa y dispase, y los BA disociados se enriquecieron con solución de iodixanol al 6%. Los BA aislados se lisaron con el reactivo Trizol para el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteína. Después del aislamiento del ARN, la fase orgánica del lisado se utilizó para la extracción de proteínas. Nuestros datos mostraron que la solución de iodixanol al 6% enriqueció eficientemente los BA sin interferir con los estudios de seguimiento de expresión génica y proteica. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales. En comparación con el tejido adiposo marrón, los BA aislados tenían una expresión significativamente mayor de Pdgfa. En resumen, este nuevo método proporciona una plataforma para estudiar la biología de los adipocitos marrones a nivel de tipo celular único.
Introduction
Tanto los ratones como los humanos tienen dos tipos de tejidos adiposos: tejido adiposo blanco (WAT) y tejido adiposo marrón (BAT)1. WAT almacena energía en forma de triglicéridos en los adipocitos blancos, y los adipocitos marrones (BA) de BAT disipan la energía química en forma de calor2. Según su origen en el desarrollo, los BA se clasifican en BA clásicos (cBA) que se formaron durante el desarrollo embrionario y BA derivados de adipocitos blancos (células beige / brite, convertidas de adipocitos blancos en condiciones de estrés)3. Los BA son multiloculares y expresan la proteína termogénica de desacoplamiento 1 (UCP1)4. El depósito interescapular de BAT (iBAT) es uno de los principales depósitos de cBA en pequeños mamíferos5, mientras que las células beige se dispersan dentro de WAT6.
Debido a su naturaleza de disipación de energía, los BA han recibido mucha atención como una diana terapéutica para reducir la obesidad7. Para explotar los BA con el propósito de tratar la obesidad, es esencial comprender los mecanismos moleculares que controlan la función, la supervivencia y el reclutamiento de los BA. Los tejidos adiposos, incluidos BAT y WAT, son heterogéneos. A excepción de los adipocitos, los tejidos adiposos contienen muchos otros tipos de células, como las células endoteliales, las células madre mesenquimales y los macrófagos8. Aunque existen herramientas genéticas para agotar específicamente los genes candidatos en ratones BA, como UCP1::Cre línea9, las técnicas para purificar BAT o WAT son limitadas, lo que dificulta el estudio de BA a nivel de tipo unicelular. Además, sin obtener BA puros, la relación entre BA y no BA no estará claramente delineada. Por ejemplo, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) se ha utilizado como marcador para células mesenquimales indiferenciadas, y se expresa en las células endoteliales e intersticiales de BAT. En las MTD estresadas por frío, las células progenitoras PDGFRα positivas dan lugar a nuevas BAs10. PDGFRα es activado por su ligando PDGF, un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales11; sin embargo, no está claro si las BA influyen en el comportamiento de las células progenitoras PDGFRα positivas mediante la secreción de PDGF.
Recientemente, se ha publicado un protocolo de aislamiento de BAs, que se basa en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)12. En este protocolo, se utilizó una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% para separar los BA de los no BA, y los BA enriquecidos se purificaron aún más mediante FACS. La aplicación de este protocolo está limitada por el requisito del proceso FACS, que se basa tanto en el equipo como en las experiencias de operación del FACS. En este estudio, se desarrolló un nuevo protocolo para aislar los BAT de las MTD. Los BA aislados por este protocolo se pueden utilizar directamente para estudios de expresión génica y proteica. Además, los datos de este estudio sugieren que los BA son un recurso importante de PDGF.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar BA para el análisis de expresión génica y proteica.
En un protocolo de aislamiento de BA publicado, se utilizó una solución BSA al 3% para enriquecer los BA12. Sin embargo, los BA enriquecidos logrados por este protocolo publicado no pudieron usarse directamente para el análisis de expresión de proteínas. Esto se debe a que la BSA concentrada existente en la solución de BA interfiere con la extracció…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud HL138454-01 y los fondos del Instituto de Investigación Médica Masónica.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
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