Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica
Summary
Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.
Abstract
O tecido adiposo marrom (BAT) é responsável pela termogênese não trêmula em mamíferos, e os adipócitos marrons (BAs) são as unidades funcionais dos BAT. Os BAs contêm gotículas lipídicas multiloculares e mitocôndrias abundantes, e expressam a proteína de desacoplamento 1 (UCP1). Os BAs são categorizados em dois subtipos com base em sua origem: BAs clássicos derivados de embriões (cBAs) e BAs derivados de adipócitos brancos. Devido à sua densidade relativamente baixa, os BAs não podem ser isolados do MTD com o método tradicional de centrifugação. Neste estudo, um novo método foi desenvolvido para isolar BAs de camundongos para análise de expressão gênica e proteica. Neste protocolo, a MTD interescapular de camundongos adultos foi digerida com solução de colagenase e dispase, e os BAs dissociados foram enriquecidos com solução de iodixanol a 6%. BAs isolados foram então lisados com reagente Trizol para isolamento simultâneo de RNA, DNA e proteína. Após o isolamento do RNA, a fase orgânica do lisado foi utilizada para a extração proteica. Nossos dados mostraram que a solução de iodixanol a 6% enriqueceu eficientemente os BAs sem interferir nos estudos de acompanhamento de expressão gênica e proteica. O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) é um fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais. Em comparação com o tecido adiposo marrom, os BAs isolados apresentaram expressão significativamente maior de Pdgfa. Em resumo, este novo método fornece uma plataforma para estudar a biologia dos adipócitos marrons em um único nível de tipo celular.
Introduction
Tanto camundongos quanto humanos possuem dois tipos de tecido adiposo: tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT)1. WAT armazena energia na forma de triglicerídeos em adipócitos brancos, e os adipócitos marrons (BAs) de MTD dissipam energia química como calor2. Com base em sua origem desenvolvimentista, os BAs são categorizados em BAs clássicos (cBAs) que se formaram durante o desenvolvimento embrionário e os BAs derivados de adipócitos brancos (células bege/brite, convertidas de adipócitos brancos sob condições de estresse)3. Os BAs são multiloculares e expressam a proteína termogênica de desacoplamento da proteína 1 (UCP1)4. O depósito de MTD interescapular (iBAT) é um dos principais depósitos de cBAs em pequenos mamíferos5, enquanto as células beges estão dispersas no WAT6.
Devido à sua natureza de dissipação de energia, os BAs têm recebido muita atenção como alvo terapêutico para a redução da obesidade7. Para explorar os BAs com a finalidade de tratar a obesidade, é essencial entender os mecanismos moleculares que controlam a função, a sobrevivência e o recrutamento dos BAs. Os tecidos adiposos, incluindo MTD e MTD, são heterogêneos. Com exceção dos adipócitos, os tecidos adiposos contêm muitos outros tipos de células, como células endoteliais, células-tronco mesenquimais e macrófagos8. Embora ferramentas genéticas para esgotar especificamente genes candidatos em BAs de camundongos estejam disponíveis, como UCP1::Cre linha9, as técnicas para purificar BAs de BAT ou WAT são limitadas, dificultando o estudo de BAs em um nível de tipo de célula única. Além disso, sem a obtenção de BAs puros, a relação entre BAs e não-BAs não será claramente delineada. Por exemplo, o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) tem sido usado como um marcador para células mesenquimais indiferenciadas, e é expresso nas células endoteliais e intersticiais de BAT. Em MTD estressadas a frio, as células progenitoras positivas para PDGFRα dão origem a novas BAs10. O PDGFRα é ativado por seu ligante PDGF, fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais11; no entanto, não está claro se os BAs influenciam o comportamento das células progenitoras positivas para PDGFRα secretando PDGF.
Recentemente, foi publicado um protocolo de isolamento de BAs, que se baseia na classificação celular ativada por fluorescência (FACS)12. Neste protocolo, a solução de albumina sérica bovina (BSA) a 3% foi usada para separar BAs de não-BAs, e os BAs enriquecidos foram purificados por FACS. A aplicação deste protocolo é limitada pela exigência do processo FACS, que depende de equipamentos e experiências de operação FACS. Neste estudo, um novo protocolo para o isolamento de BAs de MTD foi desenvolvido. Os BAs isolados por este protocolo podem ser usados diretamente para estudos de expressão gênica e proteica. Além disso, os dados deste estudo sugerem que os BAs são um importante recurso do PDGF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, um novo método de isolamento de BAs para análise de expressão gênica e proteica foi desenvolvido.
Em um protocolo de isolamento de BAs publicado, uma solução de BSA a 3% foi utilizada para enriquecer os BAs12. No entanto, os BAs enriquecidos alcançados por este protocolo publicado não puderam ser usados diretamente para a análise da expressão proteica. Isso ocorre porque a BSA concentrada existente na solução de BAs interfere no acompanhamento …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde HL138454-01 e fundos do Instituto de Pesquisa Médica Maçônica.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
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