Isolering af brune adipocytter fra murin interscapulært brunt fedtvæv til gen- og proteinekspressionsanalyse
Summary
Denne undersøgelse beskriver en ny metode til isolering af murinbrune adipocytter til gen- og proteinekspressionsanalyse.
Abstract
Brunt fedtvæv (BAT) er ansvarlig for ikke-rystende termogenese hos pattedyr, og brune adipocytter (BA’er) er de funktionelle enheder af BAT. BA’er indeholder både multilokulære lipiddråber og rigelige mitokondrier, og de udtrykker afkobling af protein 1 (UCP1). BA’er er kategoriseret i to undertyper baseret på deres oprindelse: embryoafledte klassiske BA’er (cBA’er) og hvide adipocytter afledte BA’er. På grund af deres relativt lave densitet kan BA’er ikke isoleres fra BAT med traditionel centrifugeringsmetode. I denne undersøgelse blev der udviklet en ny metode til at isolere BA’er fra mus til gen- og proteinekspressionsanalyse. I denne protokol blev interscapular BAT fra voksne mus fordøjet med Collagenase og Dispase-opløsning, og de dissocierede BA’er blev beriget med 6% iodixanolopløsning. Isolerede BA’er blev derefter lyset med Trizol-reagens til samtidig isolering af RNA, DNA og protein. Efter RNA-isolering blev den organiske fase af lysatet anvendt til proteinekstraktion. Vores data viste, at 6% iodixanolopløsning effektivt berigede BA’er uden at forstyrre opfølgende gen- og proteinekspressionsundersøgelser. Trombocytafledt vækstfaktor (PDGF) er en vækstfaktor, der regulerer vækst og spredning af mesenkymale celler. Sammenlignet med det brune fedtvæv havde isolerede BA’er signifikant højere ekspression af Pdgfa. Sammenfattende giver denne nye metode en platform til at studere biologien af brune adipocytter på et enkelt celletypeniveau.
Introduction
Både mus og mennesker har to typer fedtvæv: hvidt fedtvæv (WAT) og brunt fedtvæv (BAT)1. WAT lagrer energi i form af triglycerider i hvide adipocytter, og de brune adipocytter (BA’er) af BAT spreder kemisk energi som varme2. Baseret på deres udviklingsmæssige oprindelse kategoriseres BA’er yderligere i klassiske BA’er (cBA’er), der dannes under embryoudvikling og hvide adipocytter afledte BA’er (beige / britceller, omdannet fra hvide adipocytter under stressforhold)3. BA’er er multilokulære og udtrykker det termogeniske proteinafkoblingsprotein 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depot er et af de primære cBAs depoter i små pattedyr5, mens beige celler er spredt inden for WAT6.
På grund af deres karakter af at sprede energi har BA’er fået meget opmærksomhed som et terapeutisk mål for reduktion af fedme7. For at udnytte BA’er med det formål at behandle fedme er det vigtigt at forstå de molekylære mekanismer, der styrer BAs funktion, overlevelse og rekruttering. Fedtvæv, herunder BAT og WAT, er heterogene. Bortset fra adipocytter indeholder fedtvæv mange andre celletyper, såsom endotelceller, mesenkymale stamceller og makrofager8. Selvom genetiske værktøjer til specifikt at nedbryde kandidatgener i mus BA’er er tilgængelige, såsom UCP1::Cre linje9, er teknikker til rensning af BA’er fra BAT eller WAT begrænsede, hvilket gør det svært at studere BA’er på enkeltcelletypeniveau. Uden at opnå rene BA’er vil forholdet mellem BA’er og ikke-BA’er desuden ikke være klart afgrænset. For eksempel er blodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa (PDGFRα) blevet brugt som markør for udifferentierede mesenkymale celler, og det udtrykkes i endotel- og interstitielle celler i BAT. I koldstresset BAT giver PDGFRα-positive stamceller anledning til nye BA’er10. PDGFRα aktiveres af dets ligand PDGF, en vækstfaktor, der regulerer vækst og spredning af mesenkymale celler11; Det er imidlertid uklart, om BA’er påvirker adfærden af PDGFRα-positive stamceller ved at udskille PDGF.
For nylig er der offentliggjort en BAs-isolationsprotokol, som er baseret på fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)12. I denne protokol blev 3% bovin serumalbumin (BSA) opløsning anvendt til at adskille BA’er fra ikke-BA’er, og de berigede BA’er blev yderligere renset af FACS. Anvendelsen af denne protokol er begrænset af kravet om FACS-proces, som er afhængig af både udstyr og FACS-driftserfaringer. I denne undersøgelse blev der udviklet en ny protokol til isolering af BA’er fra BAT. De BA’er, der er isoleret af denne protokol, kan anvendes direkte til gen- og proteinekspressionsundersøgelser. Desuden tyder data fra denne undersøgelse på, at BA’er er en vigtig PDGF-ressource.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse blev der udviklet en ny metode til isolering af BA’er til gen- og proteinekspressionsanalyse.
I en offentliggjort BAs-isolationsprotokol blev 3% BSA-opløsning brugt til at berige BA’er12. Ikke desto mindre kunne de berigede BA’er, der blev opnået ved denne offentliggjorte protokol, ikke anvendes direkte til proteinekspressionsanalyse. Dette skyldes, at den koncentrerede BSA, der findes i BAs-opløsningen, interfererer med opfølgende proteinekstr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin blev støttet af National Institutes of Health HL138454-01 og Masonic Medical Research Institute midler.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
