JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie

Published: February 17, 2022
doi:
10.3791/62334
, , , , , , , , , ,
1T Cell Engineering,Mayo Clinic, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, 3Department of Radiology,Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD,Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, 6Department of Immunology,Mayo Clinic

Summary

Dit protocol beschrijft de methodologie voor het niet-invasief volgen van T-cellen die genetisch gemanipuleerd zijn om chimere antigeenreceptoren in vivo tot expressie te brengen met een klinisch beschikbaar platform.

Abstract

T-cellen die genetisch gemanipuleerd zijn om chimere antigeenreceptoren (CAR) tot expressie te brengen, hebben ongekende resultaten laten zien in cruciale klinische onderzoeken voor patiënten met B-cel maligniteiten of multipel myeloom (MM). Talrijke obstakels beperken echter de werkzaamheid en verbieden het wijdverbreide gebruik van CAR T-celtherapieën als gevolg van slechte handel en infiltratie in tumorlocaties en gebrek aan persistentie in vivo. Bovendien zijn levensbedreigende toxiciteiten, zoals cytokine release syndrome of neurotoxiciteit, grote zorgen. Efficiënte en gevoelige beeldvorming en tracking van CAR T-cellen maakt de evaluatie van T-celhandel, uitbreiding en in vivo karakterisering mogelijk en maakt de ontwikkeling van strategieën mogelijk om de huidige beperkingen van CAR T-celtherapie te overwinnen. Dit artikel beschrijft de methodologie voor het opnemen van de natriumjodidesymporter (NIS) in CAR T-cellen en voor CAR T-celbeeldvorming met behulp van [18F]tetrafluoroboraat-positronemissietomografie ([18F]TFB-PET) in preklinische modellen. De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden toegepast op andere CAR-constructies en doelgenen naast de methoden die voor deze studie worden gebruikt.

Introduction

Chimere antigeenreceptor T (CAR T) celtherapie is een snel opkomende en potentieel curatieve benadering bij hematologische maligniteiten1,2,3,4,5,6. Buitengewone klinische resultaten werden gerapporteerd na CD19-gerichte CAR T (CART19) of B-celrijpingsantigeen (BCMA) CAR T-celtherapie2. Dit leidde tot de goedkeuring door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) van CART19-cellen voor agressief B-cellymfoom (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 en lisocabtagene maraleucel)7, acute lymfoblastische leukemie (Tisa-Cel)5,8, mantelcellymfoom (brexucabtagene autoleuce)9 en folliculair lymfoom (Axi-Cel)10 . Onlangs keurde de FDA BCMA-gerichte CAR T-celtherapie goed bij patiënten met multipel myeloom (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Bovendien bevindt CAR T-celtherapie voor chronische lymfatische leukemie (CLL) zich in een laat stadium van klinische ontwikkeling en zal naar verwachting binnen de komende drie jaar goedkeuring van de FDA krijgen1.

Ondanks de ongekende resultaten van CAR T-celtherapie, wordt het wijdverbreide gebruik ervan beperkt door 1) onvoldoende in vivo CAR T-celuitbreiding of slechte handel naar tumorlocaties, wat leidt tot lagere percentages van duurzame respons12,13 en 2) de ontwikkeling van levensbedreigende bijwerkingen, waaronder cytokine release syndrome (CRS)14,15 . De kenmerken van CRS omvatten niet alleen immuunactivatie die resulteert in verhoogde niveaus van inflammatoire cytokines / chemokines, maar ook massale T-celproliferatie na CAR T-celinfusie15,16. De ontwikkeling van een gevalideerde strategie van klinische kwaliteit om CAR T-cellen in vivo in beeld te brengen, zou dus 1) CAR T-celtracking in realtime in vivo mogelijk maken om hun handel naar tumorlocaties te volgen en potentiële mechanismen van resistentie te ontdekken, en 2) monitoring van CAR T-celuitbreiding en mogelijk hun toxiciteiten voorspellen, zoals de ontwikkeling van CRS.

Klinische kenmerken van mild CRS zijn hoge koorts, vermoeidheid, hoofdpijn, huiduitslag, diarree, artralgie, myalgie en malaise. Bij ernstiger CRS kunnen patiënten tachycardie/hypotensie, capillair lek, hartdisfunctie, nier-/leverfalen en gedissemineerde intravasculaire stolling ontwikkelen17,18. Over het algemeen is aangetoond dat de mate van verhoging van cytokines, waaronder interferon-gamma, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor, interleukine (IL)-10 en IL-6, correleert met de ernst van klinische symptomen17,19. De uitgebreide toepassing van “real-time” serumcytokinemonitoring om CRS te voorspellen is echter moeilijk vanwege de hoge kosten en beperkte beschikbaarheid. Om de gunstige eigenschappen van CAR T-celtherapie te benutten, kan niet-invasieve beeldvorming van adoptieve T-cellen mogelijk worden gebruikt om de werkzaamheid, toxiciteit en terugval na CAR T-celinfusie te voorspellen.

Verschillende onderzoekers hebben strategieën ontwikkeld om op radionuclide gebaseerde beeldvorming te gebruiken met positronemissietomografie (PET) of single-photon emission computed tomography (SPECT), die een hoge resolutie en hoge gevoeligheid biedt20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 voor de in vivo visualisatie en monitoring van CAR T-celhandel. Onder die op radionucliden gebaseerde beeldvormingsstrategieën is de natriumjodidesymporter (NIS) ontwikkeld als een gevoelige modaliteit voor beeldcellen en virussen met behulp van PET-scans31,32. NIS+CAR T-celbeeldvorming met [18F]TFB-PET is een gevoelige, efficiënte en handige technologie om CAR T-celuitbreiding, -handel en -toxiciteit te beoordelen en te diagnosticeren30. Dit protocol beschrijft 1) de ontwikkeling van NIS+CAR T-cellen door middel van dubbele transductie met hoge werkzaamheid en 2) een methodologie voor het in beeld brengen van NIS+CAR T-cellen met [18F]TFB-PET-scan. BCMA-CAR T-cellen voor MM worden gebruikt als een proof-of-concept model om NIS te beschrijven als een reporter voor CAR T-celbeeldvorming. Deze methoden kunnen echter worden toegepast op elke andere CAR T-celtherapie.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board van Mayo Clinic, het Institutional Biosafety Committee en het Institutional Animal Care and Use Committee van Mayo Clinic. 1. NIS+ BCMA-CAR T-cel productie OPMERKING: Dit protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board van de Mayo Clinic (IRB 17-008762) en de Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04). Productie van BCMA-CAR, NIS en luciferase-groen …

Representative Results

Figuur 1 geeft de stappen weer voor het genereren van NIS+BCMA-CAR T-cellen. Isoleer pbmc’s op dag 0 en isoleer vervolgens T-cellen door negatieve selectie. Stimuleer vervolgens T-cellen met anti-CD3/CD28-kralen. Op dag 1 transduceren T-cellen met zowel NIS- als BCMA-CAR-lentivirussen. Tel op dag 3, 4 en 5 T-cellen en voer met media om de concentratie aan te passen op 1,0 × 106 / ml. Voeg voor NIS-getransduceerde T-cellen 1 μg/ml puromycine toe om NIS+ -cel…

Discussion

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het opnemen van NIS in CAR T-cellen en beeldvorming geïnfundeerde CAR T-cellen in vivo via [18F] TFB-PET. Als proof of concept werden NIS+BCMA-CAR T-cellen gegenereerd via dubbele transductie. We hebben onlangs gemeld dat het opnemen van NIS in CAR T-cellen de functies en werkzaamheid van DE CAR T-cel in vivo niet schaadt en CAR T-celhandel en -expansie mogelijk maakt30. Naarmate CAR T-celtherapieën zich blijven…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Mayo Clinic K2R-pijplijn (SSK), het Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) en de Predolin Foundation (RS). Figuren 1, 2 en 4 zijn gemaakt met BioRender.com.

Materials

22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973 (2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064 (2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -. M. . Anti-BCMA antibodies. , (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K. . Tissue Culture: Methods and Applications. , 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209 (2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -. C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Tags

CAR T-cellsPET ImagingNIS ReporterT-cell TraffickingT-cell ExpansionPBMC IsolationT-cell IsolationCell Culture[18F]tetrafluoroborate
check_url/62334?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image