Summary
Этот протокол описывает методологию неинвазивного отслеживания Т-клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторов химерного антигена in vivo с помощью клинически доступной платформы.
Abstract
Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторов химерного антигена (CAR), показали беспрецедентные результаты в ключевых клинических испытаниях для пациентов со злокачественными новообразованиями В-клеток или множественной миеломой (ММ). Однако многочисленные препятствия ограничивают эффективность и запрещают широкое использование терапии Т-клетками CAR из-за плохого трафика и инфильтрации в опухолевые участки, а также отсутствия персистенции in vivo. Кроме того, опасные для жизни токсичные вещества, такие как синдром высвобождения цитокинов или нейротоксичность, являются основными проблемами. Эффективная и чувствительная визуализация и отслеживание Т-клеток CAR позволяет оценить трафик, расширение и характеристику Т-клеток in vivo и позволяет разработать стратегии для преодоления текущих ограничений терапии Т-клетками CAR. В данной работе описывается методология включения симпортера йодида натрия (NIS) в Т-клетки CAR и визуализации Т-клеток CAR с использованием [18F]тетрафторборат-позитронно-эмиссионной томографии ([18F]TFB-PET) в доклинических моделях. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням в дополнение к тем, которые используются для этого исследования.
Introduction
Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CAR T) является быстро развивающимся и потенциально излечительным подходом при гематологических злокачественных новообразованиях1,2,3,4,5,6. Сообщалось о экстраординарных клинических исходах после CD19-направленной CAR T (CART19) или антигена созревания В-клеток (BCMA) CAR T-клеточной терапии2. Это привело к одобрению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) клеток CART19 для агрессивной В-клеточной лимфомы (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, тизагенлеклюцела (Tisa-Cel)3 и лизокабтагена маралеуцеля)7, острого лимфобластного лейкоза (Tisa-Cel)5,8, лимфомы мантийных клеток (brexucabtagene autoleuce)9 и фолликулярной лимфомы (Axi-Cel)10 . Совсем недавно FDA одобрило BCMA-направленную CAR T-клеточную терапию у пациентов с множественной миеломой (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Кроме того, CAR T-клеточная терапия хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) находится на поздней стадии клинической разработки и, как ожидается, получит одобрение FDA в течение следующих трех лет1.
Несмотря на беспрецедентные результаты ТЕРАПИИ Т-клетками CAR, ее широкое применение ограничено 1) недостаточным расширением Т-клеток CAR in vivo или плохой транспортировкой к опухолевым участкам, что приводит к снижению показателей длительного ответа12,13 и 2) развитием опасных для жизни нежелательных явлений, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS)14,15 . Отличительные признаки CRS включают не только иммунную активацию, приводящую к повышенным уровням воспалительных цитокинов / хемокинов, но и массивную пролиферацию Т-клеток после инфузии Т-клеток CAR15,16. Таким образом, разработка валидированной стратегии клинического уровня для изображения Т-клеток CAR in vivo позволит 1) отслеживать Т-клетки CAR в режиме реального времени in vivo для мониторинга их перемещения в опухолевые участки и выявления потенциальных механизмов резистентности и 2) мониторинга расширения Т-клеток CAR и потенциального прогнозирования их токсичности, такой как развитие CRS.
Клиническими особенностями легкой СВК являются высокая температура, усталость, головная боль, сыпь, диарея, артралгия, миалгия и недомогание. При более тяжелой СВК у пациентов может развиться тахикардия/гипотония, капиллярная утечка, сердечная дисфункция, почечная/печеночная недостаточность и диссеминированная внутрисосудистая коагуляция17,18. В целом, было показано, что степень повышения цитокинов, включая интерферон-гамма, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин (IL)-10 и IL-6, коррелирует с тяжестью клинических симптомов17,19. Тем не менее, широкое применение мониторинга цитокинов сыворотки «в режиме реального времени» для прогнозирования CRS затруднено из-за высокой стоимости и ограниченной доступности. Чтобы использовать полезные характеристики ТЕРАПИИ Т-клетками CAR, неинвазивная визуализация приемных Т-клеток может быть потенциально использована для прогнозирования эффективности, токсичности и рецидива после инфузии Т-клеток CAR.
Несколько исследователей разработали стратегии использования радионуклидной визуализации с позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ) или однофотонной эмиссионной компьютерной томографией (ОФЭКТ), которая обеспечивает высокое разрешение и высокую чувствительность20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 для визуализация in vivo и мониторинг незаконного оборота Т-клеток CAR. Среди этих стратегий визуализации на основе радионуклидов был разработан симпортер йодида натрия (NIS) в качестве чувствительного метода к клеткам изображения и вирусам с использованием ПЭТ-сканирования31,32. Визуализация Т-клеток NIS+CAR с помощью [18F]TFB-PET является чувствительной, эффективной и удобной технологией для оценки и диагностики расширения, трафика и токсичности Т-клеток CAR30. Этот протокол описывает 1) разработку Т-клеток NIS+CAR посредством двойной трансдукции с высокой эффективностью и 2) методологию визуализации Т-клеток NIS+CAR с помощью [18F]TFB-ПЭТ-сканирования. Т-клетки BCMA-CAR для MM используются в качестве экспериментальной модели для описания NIS в качестве репортера для визуализации Т-клеток CAR. Однако эти методологии могут быть применены к любой другой терапии Т-клетками CAR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол следует руководящим принципам Совета по институциональному обзору клиники Майо, Институционального комитета по биобезопасности и Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию клиники Майо.
1. Производство Т-клеток NIS+ BCMA-CAR
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол соответствует руководящим принципам Совета по институциональному обзору клиники Майо (IRB 17-008762) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC Bios00000006.04).
- Производство BCMA-CAR, NIS и люциферазно-зеленого флуоресцентного белка (GFP), кодирующих лентивирусы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция BCMA-CAR второго поколения была синтезирована de novo (см. Таблицу материалов) и клонирована в лентивирусный вектор третьего поколения под контролем промотора фактора удлинения-1 альфа (EF-1α). Конструкция BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) включала костимуляцию 4-1BB и одноцепочечный переменный фрагмент (scFv), полученный из античеловеческого клона антитела BCMA C11D5.333,34. NIS находится под контролем промотора EF-1α и связывается с геном устойчивости к пуромицину через саморасщепляющиеся пептиды (P2A). Лентивирусный вектор, кодирующий люциферазу-GFP (см. Таблицу материалов), используется для трансдукции опухолевых клеток, которые затем экспрессируют GFP и люциферазу.- Получают лентивирусные векторные плазмиды: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 мкг), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 мкг) и pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 мкг).
ПРИМЕЧАНИЕ: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro и pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro содержат ген устойчивости к пуромицину. Таким образом, NIS- или люцифераза-GFP-трансдуцированные клетки могут быть выбраны с 1 мкг/мл или 2 мкг/мл пуромицина дигидрохлорида, как описано ранее14,35. - Семена 20 × 106 из 293T клеток в колбе T175 и инкубируют в течение 24 ч при 37 °C с 5% CO2. Подтвердите, что клетки 293T равномерно распределены по колбе при 70-90% слиянии путем прямой визуализации под микроскопом.
- Подготовьте мастер-микс из 15 мкг вектора экспрессии (например, CAR, NIS или линейной ДНК люциферазы-GFP), 7 мкг вектора оболочки (VSV-G) и 18 мкг вектора упаковки (gag, pol, rev и tat). Разводят главную смесь ДНК в 4,5 мл трансфекционной среды, а затем добавляют 111 мкл предварительно комплексообразующего реагента (смесь А).
- Приготовьте новую пробирку и разбавьте 129 мкл липосомального трансфекционного реагента в 4,5 мл трансфекционной среды (смесь В).
- Соедините смеси А и В и проведите по тюбику, чтобы перемешать содержимое. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
- После инкубации просто аспирируют клеточный супернатант без отрыва клеток и добавляют 16 мл питательной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин. Затем добавьте смесь смесей А и В на ячейки 293T по каплям. Наконец, инкубируют трансфектированные клетки при 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.
- В дни 1 и 2 после трансфекции соберите супернатант 293T, открутите при 900 × г в течение 10 мин и отфильтруйте через нейлоновый фильтр 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют через 24 и 48 ч путем ультрацентрифугирования при 112 700 × г в течение 2 ч и замораживают при -80 °C.
- Получают лентивирусные векторные плазмиды: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 мкг), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 мкг) и pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 мкг).
- Ex-vivo Изоляция Т-клеток (рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните всю работу по посеву клеток в ламинарной проточной камере с использованием асептической техники и средств индивидуальной защиты. Мононуклеарные клетки периферической крови (ПБМК) собирают из здоровой донорской крови добровольцев, собранной во время афереза36. Скрининг патогенов был проведен на клетках человека, используемых в этом исследовании.- Используйте стандартный метод градиента плотности для изоляции PBMC.
- Осторожно добавляют 15 мл среды градиента плотности (плотность 1,077 г/мл) (содержащей альфа-D-глюкопиранозид, гомополимер бета-D-фруктофуранозила и 3-(ацетиламино)-5-(ацетилметиламино)-2,4,6-триодбензойную кислоту мононатриевой соли) в трубку разделения градиента плотности 50 мл без образования пузырьков воздуха (см. Таблицу материалов).
- Чтобы избежать захвата клеток, разбавьте образец крови фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, 0,2 г / л хлорида калия, 0,2 г / л моноосновного фосфата калия, 8 г / л хлорида натрия и 1,15 г / л двухосновного фосфата натрия), содержащим 2% FBS при объемном соотношении 1:1. Осторожно перенесите разбавленную кровь поверх среды градиента плотности, не нарушая границу раздела между ними. Открутите при 1 200 × г в течение 10 мин при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения 4-17 мл образца крови может быть использована разделительная трубка с градиентом плотности 50 мл. Разделительная трубка с градиентом плотности 50 мл (см. Таблицу материалов), используемая в этом протоколе, не требует «выключения тормоза» во время центрифугирования. Однако, когда используются стандартные трубки объемом 50 мл, тормоз должен быть выключен и требует 30-минутной центрифугирования. - Переложите супернатант в новую коническую трубку объемом 50 мл, промыть PBS + 2% FBS путем заполнения до 50 мл, а затем открутить вниз при 300 × г в течение 8 мин при RT.
- Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулированные клетки в 50 мл PBS + 2% FBS. Подсчитайте количество ячеек, а затем открутите вниз при 300 × г в течение 8 мин при RT. Повторите предыдущий шаг в общей сложности 2 промывки.
- Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулированные клетки до концентрации 50 × 106 клеток/мл с PBS + 2% FBS.
- Выполните изоляцию Т-клеток от НБМК с помощью магнитного набора для отрицательного отбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный набор для отрицательного отбора включает магнитные шарики, прикрепленные к антителам против антигенов, экспрессируемых на клетках, отличных от Т-клеток. Широко используемый набор содержит антитела, конъюгированные с магнитными шариками против CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 и CD16 (см. Таблицу материалов).- Перенесите НБМК в полистирольную трубку круглого дна объемом 14 мл. Затем поместите PBMCs и коктейль антител отрицательного отбора в полностью автоматизированный клеточный сепаратор и выполните изоляцию Т-клеток в соответствии с протоколом производителя.
- Используйте стандартный метод градиента плотности для изоляции PBMC.
- Стимуляция Т-клеток и расширение Т-клеток (Рисунок 1)
- Для культивирования изолированных Т-клеток готовят среду расширения Т-клеток (ТКМ), изготовленную из бессывороточной кроветвороточной клеточной среды, дополненной 10% сывороточного альбумина человека и 1% пенициллина-стрептомицина-глутамина14. После выделения Т-клеток подсчитайте клетки и культуру в концентрации 2 × 106 клеток/мл с помощью ТКМ.
- Промыть анти-CD3/ CD28 шарики три раза с TCM перед культивированием с Т-клетками.
- Смешайте флакон, содержащий бусины, закручивая. Затем пипетку необходимого объема бусин (3:1 бусины:ячейка) (например, при стимуляции 1,0 × 106 клеток Т-клеток, используют 3,0 × 106 бусин против CD3/CD28) в стерильную микроцентрифужную трубку (1,5 мл) и повторно суспендируют в 1 мл ТКМ.
- Поместите трубку микроцентрифуги с шариками на магнит на 1 мин и аспирируйте супернатант. Извлеките трубку из магнита и повторно суспендируйте вымытые шарики в 1 мл ТКМ. Повторите предыдущие два шага, чтобы выполнить в общей сложности 3 стирки.
- Повторно суспендировать шарики в 1 мл ТКМ и перенести их в Т-клетки. Затем разбавляют Т-клетки до конечной концентрации 1,0 × 106 клеток/мл с помощью ТКМ. Переложите Суспензию Т-клеток/шариков на обработанную культурой ткани 6-луночную пластину и поместите ее в инкубатор (37 °C, 5% CO2).
- Титрование лентивирусов (рисунок 2)
- Подготовьте Т-клетки для титрования. Убедитесь, что приблизительно 1,0 x 106 клеток доступны для титрования одного типа вируса.
- Стимулируют Т-клетки, как описано в разделе 1.3.2.
- Пластина 1,0 × 105 клеток стимулированных Т-клеток в 96-луночную пластину (титровую пластину) и инкубируют при 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч (рисунок 2A). Изолируют и стимулируют Т-клетки, как описано в разделе 1.2.
- Подготовьте разбавляющую пластину (96-луночную плиту) путем добавления 100 мкл ТКМ в скважины обозначенных колонн и непереведенных контрольных скважин (рисунок 2В).
- Разморозьте один флакон лентивирусных частиц на льду и аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Перенос 50 мкл супернатанта вируса в скважины колонны 6 96-луночной плиты (разбавление 3) (рисунок 2В). Пипетка вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать.
- Выполнение последовательных разбавлений (2-кратное последовательное разбавление): перенос 50 мкл из скважины А6 в скважину В6 и затем 50 мкл из скважины В6 в скважину С6; повторять до G6. Затем добавьте 50 мкл разбавленного вируса к пластине титра (рисунок 2B).
- Инкубируют титрную пластину при 37 °C, 5% CO2 в течение 48 ч и определяют процентное содержание CAR-, NIS- или GFP-положительных клеток методом проточной цитометрии (рисунок 2C).
- Промывайте лунки, откручивая пластину титра два раза при 650 × г при 4 °C в течение 3 мин.
- Окрашивают трансдуцированные Т-клетки, как описано на этапах 1.5.3-1.5.9.
- Определите титры на основе процентов CAR-, NIS- или GFP-положительных клеток с помощью формулы (1):
Титры = Процентное содержание Т-клеток BCMA-CAR+ или NIS+ × количество Т-клеток при трансдукции × удельном разбавлении/объеме (1)
- Трансдукция лентивирусов и ННГ+Расширение Т-ячеек BCMA-CAR
- Через двадцать четыре-48 ч после стимуляции Т-клеток выполняют лентивирусную трансдукцию на стимулированных Т-клетках (Т-клетки должны образовывать кластеры).
- Разморозьте замороженные лентивирусы, кодирующие CAR или NIS при 4 °C.
- Хорошо перемешайте стимулированные Т-клетки, чтобы разбить кластеры, и просто добавьте свежеотмороженный вирус при множественности инфекции (MOI) 5,0 (при преобразовании 1,0 × 106 Т-клеток используйте 5,0 × 106 лентивиронов). Инкубируют трансдуцированные клетки при 37 °C, 5% CO2.
- В дни 3, 4 и 5 подсчитайте трансдуцированные Т-клетки с помощью гематоцитометра37 или полностью автоматизированного счетчика клеток38 и отрегулируйте концентрацию клеток до 1,0 × 106 клеток / мл, добавив свежий, предварительно нагретый ТКМ. Для NIS-трансдуцированных Т-клеток, несущих ген устойчивости к пуромицину, обработайте клетки 1 мкг/мл дигидрохлорида пуромицина на 3, 4 и 5 день.
- На 6-й день удалите шарики против CD3/CD28 из трансдуцированных Т-клеток (из шага 1.3.4), хорошо перемешав, чтобы разбить кластеры Т-клеток и поместить их в магнит на 1 мин. Затем просто поместите собранные трансдуцированные Т-клетки обратно в культуру в концентрации 1,0 × 106 клеток / мл. После удаления шариков из Т-клеток оцените экспрессию CAR и NIS с помощью проточной цитометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку одноцепочечный переменный фрагмент BCMA-CAR получен от мыши, он может быть окрашен козьим антимышевым IgG (H + L), сопряженным с Alexa Fluor 647. NIS может быть обнаружен с использованием античеловеческого ETNL [синтетический пептид, соответствующий aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Это антитело распознает цитозольный С-конец NIS. Поэтому Т-клетки должны быть проницаемы перед инкубацией античеловеческим антителом NIS. - Выполните окрашивание поверхности BCMA-CAR с помощью козьего антимышечного IgG (H+L).
- Возьмите аликвоту культуры (например, 50 000 Т-клеток) и промыть буфером потока (PBS, 1% FBS и 1% азида натрия). Затем повторно суспендируют клетки с 50 мкл буфера потока и окрашивают клетки 1 мкл козьего антимышьего антитела для обнаружения экспрессии CAR и 0,3 мкл живой мертвой воды для исключения мертвых клеток.
- Инкубировать в течение 15 мин в темноте при RT, промыть клетки, добавив 150 мкл буфера потока, и центрифугировать клетки при 650 × г в течение 3 мин при 4 °C.
- После поверхностного окрашивания CAR зафиксируют и пронизывают клетки путем добавления 100 мкл фиксирующей среды (PBS с 4,21% формальдегида) и инкубируют в течение 20 мин при 4 °C. Промыть клетки дважды 100 мкл буфера, содержащего клеточно-проникающий агент, такой как сапонин (650 × г в течение 3 мин при 4 °C).
- Повторное суспендирование фиксированных/пермеабилизированных клеток в 50 мкл пермеабилизирующего буфера. Затем добавляют 0,3 нг античеловеческого антитела ETNL NIS в 50 мкл проточного буфера и инкубируют в течение 1 ч при 4 °C.
- Добавьте 150 мкл буфера потока и центрифугируйте ячейки при 650 × г в течение 3 мин при 4 °C. Инкубируют клетки с 2,5 мкл вторичного антитела против кроликов в 50 мкл буфера потока в течение 30 мин при 4 °C, промывают клетки, добавляя 150 мкл буфера потока, и центрифугу при 650 × г в течение 3 мин при 4 °C.
- Наконец, повторно суспендировать в 200 мкл буфера потока и выполнить проточную цитометрию для определения эффективности трансдукции (рисунок 3A,B).
- На 8-й день подсчитайте и раскрутите Т-клетки при 300 × г в течение 8 мин при 4 °C. Повторно суспендируют Т-клетки с морозильной средой (90% FBS + 10% диметилсульфоксида [DMSO]) в концентрации 10 × 106/мл, затем переносят по 1 мл на меченые криовиалы.
- Поместите флаконы в морозильную камеру при температуре -80 °C на 48 ч. Через 48 ч (и к 10 дню) переведите Т-клетки в жидкий азот.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор производства Т-клеток NIS+ CAR см. на рисунке 1. На рисунке 3D представлены примеры расширения Т-клеток ex vivo от трех разных доноров.
- Через двадцать четыре-48 ч после стимуляции Т-клеток выполняют лентивирусную трансдукцию на стимулированных Т-клетках (Т-клетки должны образовывать кластеры).
2. Визуализация Т-клеток NIS+ BCMA-CAR с [ 18F] TFB-ПЭТ сканированием
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол соответствует руководящим принципам Институционального комитета по уходу и использованию животных клиники Майо (IACUC A00001767-16), IRB и IBC (Bios00000006.04). OPM-2 представляет собой клеточную линию BCMA+ MM, которая часто используется в качестве линии клеток-мишеней для Т-клеток BCMA-CAR39,40.
- Устанавливают люциферазу+ BCMA+ OPM-2 клетки.
- Посейте 500 000 клеток OPM-2 в обработанную культурой ткани 24-луночную пластину. Оттаивание лентивируса, кодирующего люциферазу-GFP при 4 °C.
- Добавьте свежеотмороженный вирус при MOI 3,0 к клеткам OPM-2 и хорошо перемешайте путем пипетирования. Поместите пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO2).
- Через сорок восемь часов после трансдукции добавьте 2 мкг/мл пуромицина для отбора трансдуцированных клеток. Через четыре дня после трансдукции оценивают GFP-положительные клетки (люциферазно-положительные) с помощью проточной цитометрии (рисунок 3E).
- Установите модели мыши с ксенотрансплантатом BCMA+ OPM-2 (рисунок 4).
- Подсчитайте клетки люциферазы + OPM-2 и дважды раскрутите их вниз, чтобы удалить всю клеточную культуральную среду. Повторное суспендирование клеток OPM-2 в концентрации 10 × 106 клеток/мл с PBS.
- На -21 день вводят 100 мкл (1,0 × 106 клеток) люциферазы + OPM-2 клеток в хвосты мышей с ослабленным иммунитетом NOD-scid IL2rγnull (NSG) в возрасте от 8 до 12 недель (рисунок 4).
- На 20-й день после инъекции клеток OPM-2 (день -1 инъекции Т-клеток CAR) проверьте опухолевую нагрузку с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI) (рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки OPM-2 образуют медленно растущую опухоль, для приживления которой обычно требуется 2-3 недели. - Вводят 10 мкл/г D-люциферина мышам с ксенотрансплантатом OPM-2 с помощью внутрибрюшинной (IP) инъекции. Через 10 мин выполняют BLI на мышах под 2% газообразным изофлураном (рисунок 5А). После подтверждения приживления опухоли рандомизируйте мышей в соответствии с опухолевой нагрузкой.
- На -1 день инъекции Т-клеток CAR разморозьте Т-клетки NIS+BCMA-CAR и удалите замерзающую среду центрифугированием (300 × г, 8 мин, 4 °C). Затем повторно суспендированные клетки с ТКМ при 2,0 × 106 клеток/мл и инкубируются в течение ночи (37 °C, 5% CO2).
- На 0 день подсчитайте и центрифугируйте Т-клетки NIS+BCMA-CAR (300 × г, 8 мин, 4 °C). Повторное суспендирование Т-клеток NIS+BCMA-CAR при 50 × 106 клеток/мл с PBS.
- Вводят 100 мкл (5,0 × 106 клеток) Т-клеток NIS+BCMA-CAR посредством инъекции в хвостовую вену мышам с ксенотрансплантатом OPM-2. На 7 и 15 днях визуализируйте мышей с помощью ПЭТ-сканирования.
- NiS+BCMA-CAR визуализация Т-клеток in vivo с использованием модели мыши BCMA+OPM-2 с использованием ксенотрансплантата.
- Взвесьте мышей перед визуализацией и удалите все металлические ушные бирки, чтобы устранить артефакты, связанные с металлом.
- Подготовьте [18F]TFB, как описано выше41.
ПРИМЕЧАНИЕ: [18F]TFB должен быть изготовлен в день его использования. Радиохимическая чистота должна составлять >99%, а молярная активность >5 ГБк/ммоль. - Введите 9,25 МБк [18F]TFB внутривенно через инъекцию в хвостовую вену. Дайте период поглощения ~ 40 мин для радиоиндикатора, чтобы распределиться в организме и очистить кровь.
- Обезболить мышь с помощью ингаляции изофлурана (2%).
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран является предпочтительным ингаляционным анестетиком, поскольку он имеет быстрое и надежное начало и восстановление. - Перед обезболиванием мыши очистите все поверхности анестезиологического аппарата дезинфицирующими чистящими средствами.
- Поместите мышь внутрь индукционной камеры. Поверните циферблат испарителя на 2% и подождите, пока мышь станет лежачей и неотвечающей в течение 1-2 минут.
- Контролируйте мышь, чтобы избежать недостаточной анестезии или чрезмерного угнетения дыхательных функций. Короче говоря, ущипните палец, чтобы подтвердить недостаточную анестезию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная частота дыхания составляет до 180 / мин, а допустимая скорость падения составляет 50%. - Применяют офтальмологическую мазь, чтобы избежать высыхания и травмирования роговицы.
- Получение изображений ПЭТ/КТ через 45 минут после инъекции с помощью анестезированной мыши на рабочей станции микро-ПЭТ/КТ (см. Таблицу материалов). Затем получайте статические ПЭТ-изображения в течение 15 минут с последующим получением изображения КТ в течение 5 минут с поворотом на 360 ° и 180 проекциями при экспозиции 500 мкА, 80 кэВ и 200 мс.
- Анализ полученных данных изображений
- Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений ПЭТ (рисунок 5B и Дополнительное видео S1).
- Определите интересующий объем (VOI).
- Рассчитайте стандартизированное значение поглощения (SUV), используя формулу (2).
SUV in VOI = Концентрация активности в VOI (MBq/mL) × массе тела (г) / введенной дозе (MBq) (2)
- Подтверждение переноса Т-клеток NIS+BCMA-CAR в опухолевые участки с помощью проточной цитометрии
- После [18F]TFB-PET визуализации поместите мышь обратно в клетку. После прекращения анестезии следите за животными до тех пор, пока они не станут способными к целенаправленному движению и убедитесь, что у них есть доступ к пище и воде.
- Следите за мышами до распада введенного [18F]TFB. Как только радиоизотоп не будет обнаружен, усыпьте мышей CO2.
- Для эвтаназии поместите мышей в клетку (не более 5 мышей на клетку).
- Подвергайте мышей воздействию CO2 до полного прекращения дыхания примерно через 5-10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод эвтаназии должен соответствовать Руководству AVMA по эвтаназии животных (издание 2020 года). - Чтобы обеспечить гибель мышей, выполняют вывих шейки матки, захватив затылок и основание хвоста животного, затем раздвинув руки друг от друга.
- Соберите костный мозг, чтобы подтвердить, что Т-клетки NIS+ BCMA-CAR эффективно перемещаются к месту опухоли.
- Переложите собранные бедренные и большеберцовые кости на 6-луночную пластину, содержащую 5 мл клеточной питательной среды. Удалите мышцы и сухожилия из бедренной и большеберцовой костей и просто обрежьте оба конца (над суставами) бедренной и большеберцовой костей.
- Заполните инсулиновый шприц клеточной культуральной средой и смойте костный мозг на 6-луночную пластину. Для бедренных костей используйте иглы 22 г и шприцы 5 мл, потому что диаметр бедренной кости больше, чем у большеберцовой кости.
- Используйте плоский конец поршня для измельчения костного мозга. Поместите клеточный ситечко 70 мкм на стерильную коническую трубку объемом 50 мл и отфильтруйте измельченный костный мозг. Затем заполните трубку буфером потока и центрифугируйте трубку при 300 × г в течение 8 мин при 4 °C.
- Аспирировать супернатант и повторно суспендировать костный мозг с 5 мл буфера потока. Переложите 200 мкл костного мозга на 96-луночную пластину. Центрифугировать пластину при 300 × г в течение 3 мин при 4 °C. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте ячейки с 50 мкл буфера потока.
- Окрашивают костный мозг проточными антителами против 0,25 мкг мышиного CD45, 0,03 мкг человеческого CD45, 0,06 мкг человеческого CD3, 0,24 мкг человеческого BCMA и 0,3 мкл живой/мертвой воды. Инкубировать пластину в течение 15 мин при RT в темноте.
- Центрифугировать пластину при 300 × г в течение 3 мин при 4 °C. Затем добавьте 200 мкл буфера потока и запустите на проточном цитометре (рисунок 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны этапы генерации Т-клеток NIS+BCMA-CAR. На 0-й день изолируйте НБМК, а затем изолируйте Т-клетки путем отрицательного отбора. Затем стимулируют Т-клетки шариками против CD3/CD28. На 1-й день трансдукция Т-клеток с помощью лентивирусов NIS и BCMA-CAR. В дни 3, 4 и 5 подсчитывайте Т-клетки и кормите средой, чтобы скорректировать концентрацию до 1,0 × 106 / мл. Для NIS-трансдуцированных Т-клеток добавьте 1 мкг/мл пуромицина для выбора клеток NIS+ . На 6-й день снимите бусины, поместив ячейки в магнит на минуту. Затем поместите очищенные клетки из пробирки в новую колбу. Возьмите аликвоту клеток (например, 50 000 клеток) и окрашивайте антителами, чтобы проверить экспрессию NIS и CAR на поверхности Т-клеток с помощью проточной цитометрии. На 8 день подсчитывают Т-клетки и криоконсервируют с замораживанием среды в концентрации 10 × 106/мл.
На рисунке 2 показан контур титрования лентивирусов. На 0 день повторно суспендируют Т-клетки в концентрации 1,0 × 106/мл в ТКМ. Затем стимулируйте Т-клетки бусинами против CD3 / CD28 в соотношении 1: 3 клетки к шарикам. Добавьте 100 мкл (100 000 клеток) Т-клеток в цветные колодцы, как показано на рисунке 2А. Эта пластина называется «пластина титра». Инкубировать титрную пластину при 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч. На 1 день подготовьте разбавляющую пластину. Добавьте 100 мкл ТКМ к цветным скважинам, как показано на рисунке 2В. Затем добавьте 50 мкл свежеразмороженных лентивирусов в первый ряд (например, A6, A7 или A8, как показано на рисунке 2B). Производят последовательное разбавление путем переноса 50 мкл из А6 в В6, а затем 50 мкл из В6 в С6, повторяя до G6. Выполняйте последовательное разбавление для A7 и A8. Затем переложите 50 мкл разбавленного вируса на титрную пластину. Через двадцать четыре часа после переноса вируса с пластины разведения на пластину титра подкармливают клетки 100 мкл ТКМ. На 3 день окрашивают клетки антителами и анализируют экспрессию NIS и BCMA на Т-клетках с помощью проточной цитометрии.
На рисунке 3A,B показаны репрезентативные графики потока Т-ячеек BCMA-CAR или NIS+BCMA-CAR. Т-клетки закрыты на FSC/SSC, за которыми следуют синглетная и живая клеточная дискриминация. Более 90% клеток являются ячейками NIS+ (рисунок 3B). На рисунке 3C показан репрезентативный график потока для состава Т-клеток NIS+BCMA-CAR. Подобно рисунку 3A,B, Т-клетки ограничены FSC/SSC, за которыми следуют синглетная и живая клеточная дискриминация. На рисунке 3D показана кривая расширения Т-клеток от 0 до 8 дней. Нет различий в складном расширении между ячейками UTD, BCMA-CAR T или NIS + BCMA-CAR. На рисунке 3E показана экспрессия GFP на клетках OPM-2 после трансдукции лентивируса, который кодирует GFP и люциферазу с последующим выделением пуромицина.
На рисунке 4 показан контур визуализации Т-клеток NIS+BCMA-CAR in vivo с помощью [18F]TFB-PET. Инокулируйте шести-восьминедельных мышей с 1,0 × 106 клеток люциферазы + OPM-2 с помощью инъекции в хвостовую вену на день -21. Оценить опухолевую нагрузку по БЛИ на день -1. На 0-й день рандомизируйте мышей в соответствии с опухолевой нагрузкой, подлежащей лечению Т-клетками NIS + BCMA-CAR посредством инъекции в хвостовую вену или контролировать без какого-либо лечения (необработанный ксенотрансплантат). Представьте себе мышей с BLI на 6-й день. Выполните [18F]TFB-PET на 7-й день для получения изображения Т-клеток NIS+BCMA-CAR.
На рисунке 5А показан репрезентативный BLI через 20 дней после посева клеток люциферазы+OPM-2 мышам NSG. На рисунке 5B показана репрезентативная ПЭТ-визуализация через неделю после введения Т-клеток NIS+BCMA-CAR. [18Ф] Поглощение TFB наблюдается в грудине, шипах, тазу и бедренных костях. Кроме того, физиологическое поглощение [18F]TFB наблюдается в щитовидной железе и желудке. На рисунке 5C показаны репрезентативные графики потока бедренного костного мозга, собранного из необработанного ксенотрансплантата или мышей, обработанных Т-клетками NIS + BCMA-CAR. Образцы костного мозга окрашиваются CD45 мыши, CD45 человека, CD3 человека и BCMA человека. Клетки закрыты на FSC / SSC, за которыми следуют синглетная, живая и человеческая дискриминация клеток. Образцы костного мозга, полученные из необработанного ксенотрансплантата, показывают клетки BCMA+ , тогда как мыши, обработанные Т-клетками NIS + BCMA-CAR, показывают клетки CD3 + , которые поддерживают обнаружение [18F] TFB-PET.
Рисунок 1: Схема производства Т-клеток NIS+BCMA-CAR. Нормальные донорские CD3 Т-клетки (выделенные из мононуклеарных клеток периферической крови) с использованием отрицательного отбора шариков. Т-клетки покрываются при 1,0 × 106 /мл и расширяются в ТКМ с использованием бусин против CD3 / CD28, добавляемых на 0-й день посева и удаляемых на 6-й день. Т-клетки дуально трансдуцируются лентивирусами, кодирующими NIS или BCMA-CAR на 1-й день (MOI=5.0). Т-клетки NIS+BCMA-CAR обрабатывают 1 мкг/мл пуромицина на 3, 4 и 5 день. Т-клетки расширяют в культуре в течение 8 дней. Т-клетки криоконсервируются в FBS с 10% DMSO для будущих экспериментов. Т-клетки размораживают и отдыхают в течение ночи при 37 °C перед всеми экспериментами. Сокращения: CD = кластер дифференциации; TCM = среда расширения Т-клеток; BCMA = антиген созревания В-клеток; CAR = рецептор химерного антигена; NIS = симпортер йодида натрия; GFP = зеленый флуоресцентный белок; PBMCs = мононуклеарные клетки периферической крови; МВД = множественность инфекции; FBS = фетальная бычья сыворотка; ДМСО = диметилсульфоксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Титрование лентивируса. (А) На 0-й день стимулируйте Т-клетки анти-CD3/CD28 шариками в соотношении 3:1 бусины:клетки. Добавьте 100 мкл 1,0 × 106/мл стимулированных Т-клеток в цветные лунки, как указано в мультфильме. Затем инкубируют титрную пластину при 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч. (B) Подготовьте разбавляющую пластину, добавив 100 мкл ТКМ в цветные колодцы, как указано в мультфильме. Добавьте 50 мкл свежеразмороженного вируса к A6, A7 или A8 (например, BCMA-CAR к A6, NIS к A7 и люцифераза-GFP к A8). Затем последовательно разбавляют вирус путем переноса 50 мкл из А6 в В6, а затем 50 мкл из В6 в С6, повторяя до G6. Выполняйте последовательное разбавление для A7 и A8. Перенесите 50 мкл разбавленного вируса на титрную пластину. (C) На 3-й день окрашивают клетки соответствующими антителами и анализируют пластину титра с помощью проточной цитометрии. Сокращения: CD = кластер дифференциации; TCM = среда расширения Т-клеток; BCMA = антиген созревания В-клеток; CAR = рецептор химерного антигена; NIS = симпортер йодида натрия; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Генерация Т-клеток NIS+BCMA-CAR и люцифераз-GFP-положительных клеток OPM-2. (А и В) Клетки закрыты на FSC/SSC, за которыми следует синглетная и живая клеточная дискриминация. Показаны репрезентативные графики потока (A) нетрансдуцированных Т- клеток и Т-клеток BCMA-CAR и (B) UTD и NIS+BCMA-CAR T. Т-клетки NIS+BCMA-CAR генерируются котрансдукцией двух вирусов на 1-й день расширения Т-клеток, как описано на рисунке 2. На 6-й день клетки окрашиваются для CAR и NIS. С) Фенотипический анализ ННГ+БКМА-КАР Т. Показан репрезентативный график потока Т-клеток NIS+BCMA-CAR. (D) Краткое изложение кинетики роста Т-клеток UTD, BCMA-CAR T или NIS+BCMA-CAR. Инкорпорация BCMA-CAR и/или NIS не влияет на расширение Т-клеток (двусторонняя ANOVA, n=3 биологических репликаций, средняя ± SD). (E) Проточный цитометрический анализ люциферазы-GFP-трансдуцированной OPM-2. Клетки OPM-2 трансдуцируются лентивирусом, кодирующим люциферазу-GFP с устойчивостью к пуромицину. Через сорок восемь часов после трансдукции клетки OPM-2 обрабатывают 2 мкг/мл пуромицина. Клетки расширяются еще на два дня, а экспрессия GFP анализируется с помощью проточной цитометрии. Сокращения: CD = кластер дифференциации; BCMA = антиген созревания В-клеток; CAR = рецептор химерного антигена; NIS = симпортер йодида натрия; GFP = зеленый флуоресцентный белок; UTD = непереведенный; FSC/SSC = прямое рассеяние/боковое рассеяние; ANOVA = дисперсионный анализ; n.s.= незначимый; SD = стандартное отклонение; FL-1-A = площадь флуорофора 1; FITC-A = площадь изотиоцианата флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Схема анализа трафика in vivo в системной модели ксенотрансплантата OPM2. Вводите шести-восьминедельным мышам NSG 1,0 × 106 люцифераз-положительных клеток OPM-2 через хвостовую вену на 21-й день. На 1-й день выполните биолюминесцентную визуализацию на мышах, чтобы подтвердить приживление клеток OPM-2. На 0-й день мышам вводят 5,0 × 106 Т-клеток NIS+BCMA-CAR. Изображение мышей с [18F]TFB-PET/CT на 7-й день для оценки трафика Т-клеток NIS+BCMA-CAR. Сокращения: BCMA = антиген созревания В-клеток; CAR = рецептор химерного антигена; NIS = симпортер йодида натрия; BLI = биолюминесцентная визуализация; NSG = иммунокомпрометированный NOD-scid IL2rγnull; luc = люцифераза; [18Ф] TFB-PET/CT = [18F]тетрафторборатная позитронно-эмиссионная томография/компьютерная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ незаконного оборота in vivo в системной модели ксенотрансплантата OPM2. (А и В) Клетки BCMA+люциферазы+OPM2 внутривенно вводят мышам NSG. Мыши получают Т-клетки NIS+BCMA CAR через три недели после посева клеток OPM-2. (A) BLI подтверждает приживление клеток OPM-2. (B) [18F]TFB-PET выявляет перенос Т-клеток NIS+BCMA-CAR в костный мозг. (C) Чтобы подтвердить, что клетки OPM-2 приживаются в костном мозге, а Т-клетки NIS + BCMA-CAR перемещаются к месту опухоли, мышей усыпляют после визуализации, и костный мозг собирают. Проточный цитометрический анализ показал, что клетки OPM-2 приживаются в костном мозге (слева), а Т-клетки NIS +BCMA-CAR присутствуют в костном мозге (справа). Сокращения: BCMA = антиген созревания В-клеток; CAR = рецептор химерного антигена; NIS = симпортер йодида натрия; BLI = биолюминесцентная визуализация; NSG = иммунокомпрометированный NOD-scid IL2rγnull; [18Ф] TFB-PET/CT = [18F]тетрафторборатно-позитронно-эмиссионная томография/компьютерная томография; IVIS = система визуализации in vivo; CD = кластер дифференциации; Внедорожник = стандартизированное значение поглощения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео S1: Трехмерный (3D) рендеринг данных ПЭТ/КТ, показывающий распределение in vivo [18F]TFB в щитовидной железе, желудке и костном мозге. Сокращения: BCMA = антиген созревания В-клеток; CAR = рецептор химерного антигена; NIS = симпортер йодида натрия; ПЭТ/КТ = позитронно-эмиссионная томография/компьютерная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе описывается методология включения NIS в Т-клетки CAR и визуализации инфузионных CAR T-клеток in vivo через [18F]TFB-PET. В качестве доказательства концепции, Т-клетки NIS + BCMA-CAR были сгенерированы с помощью двойной трансдукции. Недавно мы сообщили, что включение NIS в CAR T-клетки не ухудшает функции и эффективность CAR T-клеток in vivo и позволяет трафик и расширение CAR T-клеток30. Поскольку терапия Т-клетками CAR продолжает расширяться за пределы текущих злокачественных новообразований В-клеток до приложений в ХЛЛ, будет возрастать потребность в инструментах, которые позволяют неинвазивную визуализацию in vivo и мониторинг инфузионных приемных Т-клеток. Динамическая визуализация Т-клеток позволит валидировать адоптимусный трафик Т-клеток и потенциально позволит на более раннем этапе обнаружить эффективность и токсичность.
НИС был исследован и подтвержден как чувствительный метод к имиджевым клеткам и вирусам в клинических испытаниях32,42. Физиологическое накопление индикаторов для NIS в основном наблюдается в щитовидной железе / слюнных железах, желудке и мочевом пузыре, которые не являются общими органами, пораженными жидкими опухолями44. Особенно при ММ злокачественные плазматические клетки часто распределяются в костном мозге или костях, а экстрамедуллярная плазмацитома при поражениях, где происходит физиологическое накопление индикаторов для НИС, является редким явлением44,45. Кроме того, НИС не является иммуногенным и поэтому подходит для продольных исследований изображений46. NIS является внутренним мембранным белком, который транспортирует йодид в цитозоль и содержит 13 предполагаемых трансмембранных сегментов с внеклеточным аминоконцевым участком и цитозольным карбокси-концом47.
NIS можно визуализировать с помощью гамма- или позитронно-излучающих радиоизотопов, таких как пертехнетат технеция-99m (99mTc), йодид-123 (123I), 131I, 124I и [18F]TFB43. В последнее время [18F]TFB стал перспективным йодидным аналогом для ПЭТ-визуализации на основе NIS, поскольку он обладает аналогичными биохимическими свойствами и радиосинтезирует48. Одним из преимуществ TFB является то, что он не подвергается органификации в клетках щитовидной железы и, следовательно, имеет сравнительно мягкое поглощение в нормальной ткани щитовидной железы48. Еще одним преимуществом TFB является его короткий период полураспада 109,8 мин, в то время как период полураспада других индикаторов колеблется от 12 ч до 8 дней, что может представлять проблемы безопасности для клинических применений49. Основным ограничением визуализации Т-клеток CAR на основе NIS является то, что индикаторы, включая TFB, не проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что затрудняет оценку нейротоксичности после лечения Т-клетками CAR50,51,52,53.
Нейротоксичность связана с инфильтрацией Т-клеток и активацией миелоидных клеток в центральной нервной системе. Однако в большинстве случаев нейротоксичности после ТЕРАПИИ Т-клетками CAR целостность ГЭБ нарушается50,54. Поэтому неясно, не может ли индикатор пересечь ГЭБ в этой скомпрометированной настройке. Необходимо провести дальнейшие исследования, чтобы проверить, может ли нейротоксичность после терапии Т-клетками CAR быть визуализирована с помощью [18F] TFB-PET. Хотя короткий период полураспада [18F]TFB безопасен для пациентов и персонала, он затрудняет его закупку для больницы. Поэтому институты должны быть оснащены циклотронами или иметь доступ к региональному объекту. Методология, описанная в протоколе здесь, потенциально может быть применена к множеству других Т-клеток CAR посредством двойной трансдукции для визуализации и оценки CAR T-клеток in vivo с использованием сканирования [18F]TFB-PET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SSK является изобретателем патентов в области иммунотерапии CAR, лицензированных Novartis (через соглашение между клиникой Mayo, Университетом Пенсильвании и Novartis) и Mettaforge (через клинику Mayo). RS, MJC и SSK являются изобретателями патентов в области иммунотерапии CAR, которые лицензированы Humanigen. SSK получает финансирование исследований от Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs и Lentigen. Рисунки создавались с помощью BioRender.com.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана через трубопровод Mayo Clinic K2R (SSK), Центр индивидуализированной медицины клиники Майо (SSK) и Фонд Предолина (RS). Рисунки 1, 2 и 4 были созданы с BioRender.com.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
- Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
- Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
- Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
- Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
- Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
- Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
- Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
- Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
- Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973 (2020).
- Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
- Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
- Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
- Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
- Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
- Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
- Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
- Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
- Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
- Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064 (2016).
- Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
- Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
- Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
- Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
- Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
- Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
- Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
- Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
- Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
- Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
- Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
- Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
- Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
- Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
- Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
- Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209 (2018).
- Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
- Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
- Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
- Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
- Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
- Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
- Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).