यह प्रोटोकॉल गैर-आक्रामक रूप से ट्रैकिंग टी कोशिकाओं के लिए पद्धति का वर्णन करता है जो नैदानिक रूप से उपलब्ध मंच के साथ विवो में चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर हैं।
आनुवंशिक रूप से चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर टी कोशिकाओं ने बी सेल दुर्दमताओं या मल्टीपल मायलोमा (एमएम) वाले रोगियों के लिए निर्णायक नैदानिक परीक्षणों में अभूतपूर्व परिणाम दिखाए हैं। हालांकि, कई बाधाएं प्रभावकारिता को सीमित करती हैं और खराब तस्करी और ट्यूमर साइटों में घुसपैठ के साथ-साथ विवो में दृढ़ता की कमी के कारण सीएआर टी सेल थेरेपी के व्यापक उपयोग को प्रतिबंधित करती हैं। इसके अलावा, जीवन-धमकी देने वाली विषाक्तताएं, जैसे कि साइटोकाइन रिलीज सिंड्रोम या न्यूरोटॉक्सिसिटी, प्रमुख चिंताएं हैं। कुशल और संवेदनशील इमेजिंग और CAR T कोशिकाओं की ट्रैकिंग टी सेल तस्करी, विस्तार, और विवो लक्षण वर्णन में के मूल्यांकन को सक्षम बनाता है और CAR T सेल थेरेपी की वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए रणनीतियों के विकास की अनुमति देता है। यह पेपर कार टी कोशिकाओं में सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर (एनआईएस) को शामिल करने और प्रीक्लिनिकल मॉडल में [18 एफ] टेट्राफ्लोरोबोरेट-पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी ([18 एफ] टीएफबी-पीईटी) का उपयोग करके सीएआर टी सेल इमेजिंग के लिए पद्धति का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों को इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों के अलावा अन्य सीएआर निर्माणों और लक्षित जीनों पर लागू किया जा सकता है।
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (सीएआर टी) सेल थेरेपी हेमेटोलॉजिकल दुर्दमताओं में एक तेजी से उभरता हुआ और संभावित रूप से उपचारात्मक दृष्टिकोण है1,2,3,4,5,6। CD19-निर्देशित CAR T (CART19) या B सेल परिपक्वता एंटीजन (BCMA) CAR T सेल थेरेपी 2 के बाद असाधारण नैदानिक परिणामों की सूचना दी गई थी। इसने यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) को आक्रामक बी-सेल लिंफोमा (एक्सीकैबटेन सिलोल्यूसेल (एक्सी-सेल)4, टिसाजेनलेक्ल्यूसेल (टीसा-सेल)3, और लिसोकाबैटेजेन मैरालूसेल)7, तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (तीसा-सेल)5,8, मेंटल सेल लिंफोमा (ब्रेक्सुकाबैटेजेन ऑटोल्यूस)9, और कूपिक लिंफोमा (एक्सी-सेल) 10, और कूपिक लिंफोमा (एक्सी-सेल) 10 के लिए CART19 कोशिकाओं के अनुमोदन का नेतृत्व किया। . हाल ही में, एफडीए ने कई मायलोमा (एमएम) (आइडेकाबटेजेन विक्ल्यूसेल) वाले रोगियों में बीसीएमए-निर्देशित सीएआर टी सेल थेरेपी को मंजूरी दी। इसके अलावा, क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) के लिए सीएआर टी सेल थेरेपी देर से चरण के नैदानिक विकास में है और अगले तीन वर्षों के भीतर एफडीए अनुमोदन प्राप्त करने की उम्मीद है।
CAR T सेल थेरेपी के अभूतपूर्व परिणामों के बावजूद, इसका व्यापक उपयोग 1) विवो CAR T सेल विस्तार में अपर्याप्त या ट्यूमर साइटों के लिए खराब तस्करी द्वारा सीमित है, जो टिकाऊ प्रतिक्रिया की कम दर की ओर जाता है12,13 और 2) साइटोकाइन रिलीज सिंड्रोम (CRS) 14,15 सहित जीवन-धमकी वाली प्रतिकूल घटनाओं का विकास . सीआरएस की पहचान में न केवल प्रतिरक्षा सक्रियण शामिल है जिसके परिणामस्वरूप भड़काऊ साइटोकिन्स / केमोकाइन्स का ऊंचा स्तर होता है, बल्कि सीएआर टी सेल इन्फ्यूजन 15,16 के बाद बड़े पैमाने पर टी सेल प्रसार भी शामिल होता है। इस प्रकार, विवो में सीएआर टी कोशिकाओं की छवि के लिए एक मान्य, नैदानिक-ग्रेड रणनीति का विकास 1) विवो में वास्तविक समय में सीएआर टी सेल ट्रैकिंग को ट्यूमर साइटों पर उनकी तस्करी की निगरानी करने और प्रतिरोध के संभावित तंत्र को उजागर करने की अनुमति देगा, और 2) सीएआर टी सेल विस्तार की निगरानी और संभावित रूप से सीआरएस के विकास जैसे उनके विषाक्तताओं की भविष्यवाणी करना।
हल्के सीआरएस की नैदानिक विशेषताएं उच्च बुखार, थकान, सिरदर्द, दाने, दस्त, आर्थ्राल्जिया, मायल्जिया और अस्वस्थता हैं। अधिक गंभीर सीआरएस में, रोगियों को टैचीकार्डिया / हाइपोटेंशन, केशिका रिसाव, हृदय रोग, गुर्दे / यकृत विफलता, और प्रसारित इंट्रावैस्कुलर जमावट 17,18 विकसित हो सकते हैं। सामान्य तौर पर, इंटरफेरॉन-गामा, ग्रैनुलोसाइट्स-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक, इंटरल्यूकिन (आईएल) -10, और आईएल -6 सहित साइटोकिन्स की ऊंचाई की डिग्री को नैदानिक लक्षणों की गंभीरता के साथ सहसंबंधित दिखाया गया है17,19। हालांकि, सीआरएस की भविष्यवाणी करने के लिए “वास्तविक समय” सीरम साइटोकाइन निगरानी का व्यापक अनुप्रयोग उच्च लागत और सीमित उपलब्धता के कारण मुश्किल है। CAR T सेल थेरेपी की लाभकारी विशेषताओं का फायदा उठाने के लिए, दत्तक टी कोशिकाओं की गैर-इनवेसिव इमेजिंग का उपयोग संभावित रूप से CAR T सेल जलसेक के बाद प्रभावकारिता, विषाक्तता और पुनरावृत्ति की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।
कई शोधकर्ताओं ने पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) या एकल-फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT) के साथ रेडियोन्यूक्लाइड-आधारित इमेजिंग का उपयोग करने के लिए रणनीतियां विकसित की हैं, जो उच्च रिज़ॉल्यूशन और उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 विवो विज़ुअलाइज़ेशन और CAR T सेल तस्करी की निगरानी में. उन रेडियोन्यूक्लाइड-आधारित इमेजिंग रणनीतियों में, सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर (एनआईएस) को पीईटी स्कैन 31,32 का उपयोग करके छवि कोशिकाओं और वायरस के लिए एक संवेदनशील रूपरेखा के रूप में विकसित किया गया है। [18F] TFB-PET के साथ NIS + CAR T सेल इमेजिंग CAR T सेल विस्तार, तस्करी और विषाक्तता 30 का आकलन और निदान करने के लिए एक संवेदनशील, कुशल और सुविधाजनक तकनीक है। यह प्रोटोकॉल 1) उच्च प्रभावकारिता के साथ दोहरे ट्रांसडक्शन के माध्यम से NIS + CAR T कोशिकाओं का विकास और 2) [18F] TFB-PET स्कैन के साथ NIS + CAR T कोशिकाओं को इमेजिंग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है। MM के लिए BCMA-CAR T कोशिकाओं का उपयोग CAR T सेल इमेजिंग के लिए एक रिपोर्टर के रूप में NIS का वर्णन करने के लिए एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट मॉडल के रूप में किया जाता है। हालांकि, इन तरीकों को किसी भी अन्य सीएआर टी सेल थेरेपी पर लागू किया जा सकता है।
यह पेपर एनआईएस को सीएआर टी कोशिकाओं में शामिल करने और [18F] TFB-PET के माध्यम से विवो में CAR T कोशिकाओं को इमेजिंग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, एनआईएस + बीसीएमए-क?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को आंशिक रूप से मेयो क्लिनिक K2R पाइपलाइन (SSK), मेयो क्लिनिक सेंटर फॉर इंडिविजुअलाइज्ड मेडिसिन (एसएसके), और प्रेडोलिन फाउंडेशन (आरएस) के माध्यम से समर्थित किया गया था। आंकड़े 1, 2, और 4 BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |