Denne protokol beskriver metoden til ikke-invasiv sporing af T-celler, der er genetisk manipuleret til at udtrykke kimære antigenreceptorer in vivo med en klinisk tilgængelig platform.
T-celler, der er genetisk manipuleret til at udtrykke kimære antigenreceptorer (CAR), har vist hidtil usete resultater i pivotale kliniske forsøg for patienter med B-cellemaligniteter eller myelomatose (MM). Imidlertid begrænser mange hindringer effektiviteten og forbyder den udbredte anvendelse af CAR T-celleterapier på grund af dårlig handel og infiltration i tumorsteder samt manglende vedholdenhed in vivo. Desuden er livstruende toksiciteter, såsom cytokinfrigivelsessyndrom eller neurotoksicitet, store bekymringer. Effektiv og følsom billeddannelse og sporing af CAR T-celler muliggør evaluering af T-cellehandel, ekspansion og in vivo-karakterisering og muliggør udvikling af strategier til at overvinde de nuværende begrænsninger ved CAR T-celleterapi. Dette papir beskriver metoden til inkorporering af natriumiodidsymporteren (NIS) i CAR T-celler og til CAR T-cellebilleddannelse ved hjælp af [18F] tetrafluorborat-positronemissionstomografi ([18F] TFB-PET) i prækliniske modeller. De metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan anvendes på andre CAR-konstruktioner og målgener ud over dem, der anvendes til denne undersøgelse.
Kimær antigenreceptor T (CAR T) celleterapi er en hurtigt voksende og potentielt helbredende tilgang i hæmatologiske maligniteter1,2,3,4,5,6. Ekstraordinære kliniske resultater blev rapporteret efter CD19-rettet CAR T (CART19) eller B-cellemodningsantigen (BCMA) CAR T-celleterapi2. Dette førte til, at US Food and Drug Administration (FDA) godkendte CART19-celler til aggressivt B-cellelymfom (axicabtagen ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 og lisocabtagene maraleucel)7, akut lymfoblastær leukæmi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellelymfom (brexucabtageneautoleuce)9 og follikulært lymfom (Axi-Cel)10 . Senest har FDA godkendt BCMA-rettet CAR T-celleterapi til patienter med myelomatose (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Desuden er CAR T-celleterapi til kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) i sen klinisk udvikling og forventes at modtage FDA-godkendelse inden for de næste tre år1.
På trods af de hidtil usete resultater af CAR T-celleterapi er dens udbredte anvendelse begrænset af 1) utilstrækkelig in vivo CAR T-celleudvidelse eller dårlig handel med tumorsteder, hvilket fører til lavere satser for varig respons12,13 og 2) udvikling af livstruende bivirkninger, herunder cytokinfrigivelsessyndrom (CRS)14,15 . Kendetegnene ved CRS omfatter ikke kun immunaktivering, hvilket resulterer i forhøjede niveauer af inflammatoriske cytokiner / kemokiner, men også massiv T-celleproliferation efter CAR T-celleinfusion15,16. Udviklingen af en valideret strategi af klinisk kvalitet til at afbilde CAR T-celler in vivo vil således gøre det muligt for 1) CAR T-cellesporing i realtid in vivo at overvåge deres handel til tumorsteder og afdække potentielle resistensmekanismer og 2) overvågning af CAR T-celleudvidelse og potentielt forudsigelse af deres toksiciteter såsom udvikling af CRS.
Kliniske træk ved mild CRS er høj feber, træthed, hovedpine, udslæt, diarré, artralgi, myalgi og utilpashed. Ved mere alvorlig CRS kan patienter udvikle takykardi/hypotension, kapillær lækage, hjertedysfunktion, nyre-/leversvigt og dissemineret intravaskulær koagulation17,18. Generelt har graden af forhøjelse af cytokiner, herunder interferon-gamma, granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor, interleukin (IL)-10 og IL-6, vist sig at korrelere med sværhedsgraden af kliniske symptomer17,19. Den omfattende anvendelse af “realtids” serumcytokinovervågning til forudsigelse af CRS er imidlertid vanskelig på grund af de høje omkostninger og den begrænsede tilgængelighed. For at udnytte de gavnlige egenskaber ved CAR T-celleterapi kan ikke-invasiv billeddannelse af adoptive T-celler potentielt bruges til at forudsige effektiviteten, toksiciteterne og tilbagefaldet efter CAR T-celleinfusion.
Flere forskere har udviklet strategier til at anvende radionuklidbaseret billeddannelse med positronemissionstomografi (PET) eller enkeltfotonemissionscomputertomografi (SPECT), som giver høj opløsning og høj følsomhed20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 for in vivo visualisering og overvågning af CAR T cellehandel. Blandt disse radionuklidbaserede billeddannelsesstrategier er natriumiodidsymporteren (NIS) udviklet som en følsom modalitet over for billedceller og vira ved hjælp af PET-scanninger31,32. NIS+CAR T-cellebilleddannelse med [18F]TFB-PET er en følsom, effektiv og praktisk teknologi til vurdering og diagnosticering af CAR T-celleudvidelse, -handel og –toksicitet30. Denne protokol beskriver 1) udviklingen af NIS + CAR T-celler gennem dobbelt transduktion med høj effektivitet og 2) en metode til billeddannelse af NIS + CAR T-celler med [18F] TFB-PET-scanning. BCMA-CAR T-celler til MM bruges som en proof-of-concept-model til at beskrive NIS som reporter for CAR T-cellebilleddannelse. Disse metoder kan dog anvendes på enhver anden CAR T-celleterapi.
Dette papir beskriver en metode til inkorporering af NIS i CAR T-celler og billeddannelse af infunderede CAR T-celler in vivo gennem [18F] TFB-PET. Som bevis på konceptet blev NIS + BCMA-CAR T-celler genereret via dobbelt transduktion. Vi har for nylig rapporteret, at inkorporering af NIS i CAR T-celler ikke forringer CAR T-cellefunktioner og effektivitet in vivo og tillader CAR T-cellehandel og –udvidelse30. Da CAR T-celleterapier fortsætter med at ekspan…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet gennem Mayo Clinic K2R pipeline (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) og Predolin Foundation (RS). Figur 1, 2 og 4 blev oprettet med BioRender.com.
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |