Analyse von Motilitätsmustern von Stentor während und nach der oralen Apparateregeneration mittels Zellverfolgung
Summary
Wir stellen ein Protokoll zur Charakterisierung der Motilität und des Verhaltens einer Population von hundert Mikro- bis Millimeterzellen mittels Hellfeldmikroskopie und Zellverfolgung vor. Dieser Assay zeigt, dass Stentor coeruleus bei der Regeneration eines verlorenen oralen Apparates vier verhaltensunterschiedene Phasen durchläuft.
Abstract
Stentor coeruleus ist ein bekannter Modellorganismus zur Erforschung der einzelligen Regeneration. Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen ergab Hunderte von Genen – von denen viele nicht mit dem oralen Apparat (OA) assoziiert sind –, die während des gesamten Regenerationsprozesses in Phasen unterschiedlich reguliert werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese systemische Reorganisation und Mobilisierung zellulärer Ressourcen für das Wachstum einer neuen OA zu beobachtbaren Veränderungen in Bewegung und Verhalten führen wird, die im Laufe der Zeit den Phasen der differentiellen Genexpression entsprechen. Die morphologische Komplexität von S. coeruleus erforderte jedoch die Entwicklung eines Assays zur Erfassung der Statistiken und der Zeitskala. Ein benutzerdefiniertes Skript wurde verwendet, um Zellen in kurzen Videos zu verfolgen, und Statistiken wurden über eine große Population (N ~ 100) zusammengestellt. Mit dem Verlust der OA verliert S. coeruleus zunächst die Fähigkeit zur gerichteten Bewegung; Dann, beginnend bei ~ 4 h, zeigt es einen signifikanten Rückgang der Geschwindigkeit bis ~ 8 h. Dieser Assay bietet ein nützliches Werkzeug für das Screening von Motilitätsphänotypen und kann für die Untersuchung anderer Organismen angepasst werden.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) ist ein bekannter Modellorganismus, der aufgrund seiner Größe, seiner Fähigkeit, mehreren mikrochirurgischen Techniken standzuhalten, und der einfachen Kultivierung in einem Labor zur Untersuchung der einzelligen Regenerationverwendet wurde 1,2,3. Frühe Regenerationsstudien konzentrierten sich auf das größte und morphologisch deutlichste Merkmal in Stentor – die OA -, die vollständig nach chemischem Schock 4,5,6 ausgeschieden wird. Der De-novo-Ersatz einer verlorenen OA beginnt mit der Entstehung eines neuen membranellaren Bandes – einer Reihe von Zilien, die sich allmählich in Richtung der Vorderseite der Zelle verschieben, bevor sie eine funktionelle OA über acht morphologische Stadienbilden 3. Diese Stadien wurden unabhängig von der Temperatur sequenziell beobachtet und bieten einen universellen Bezugspunkt für fast alle Studien5.
Die mechanistische Analyse der Stentor-Regeneration erfordert Werkzeuge zur Messung des Zeitpunkts der Regeneration, die robust und einfach genug sind, um als Teil eines chemischen oder molekularen Screens auf mehrere Proben angewendet zu werden. Die Standardmethode zur Durchführung eines zellbasierten Assays ist die Bildgebung, in diesem Fall die Abbildung der Bildung neuer OA während der Regeneration. Solche bildgebenden Assays sind jedoch am effektivsten, wenn die regenerierende Struktur verschiedene molekulare Komponenten enthält, die als Marker verwendet werden können, so dass sie in einem Fluoreszenzbild leicht nachgewiesen werden können. Im Falle des Stentor OA sind die bekannten Komponenten (Zilien, Basalkörper) auch auf dem Rest der Zelloberfläche vorhanden; Daher kann das Erkennen der Wiederherstellung der OA nicht einfach dadurch erreicht werden, dass nach dem Vorhandensein oder Fehlen einer Komponente gesucht wird.
Vielmehr wäre eine Form der Formerkennung erforderlich, um eine OA zu erkennen, und dies ist möglicherweise sehr herausfordernd, da Stentor-Zellen ihre Form oft über einen schnellen kontraktilen Prozess ändern. Dieses Papier stellt einen alternativen Assay für die Regeneration vor, der auf der beweglichen Aktivität des Körpers und der OA-Zilien beruht. Wenn sich die OA regeneriert, erfahren die neu gebildeten Zilien reproduzierbare Veränderungen in Position und Aktivität, was wiederum die Schwimmmotilität der Zelle beeinflusst. Durch die Analyse der Motilität ist es möglich, einen Assay für die “funktionelle Regeneration” durchzuführen, der die Regeneration quantifiziert, indem die Funktion der regenerierten Strukturen quantifiziert wird. Frühere Analysen der Stentor ciliary Funktion während der Regeneration verwendeten Partikelbild-Velocimetrie, kombiniert mit Tracer-Perlen, die dem externen Medium hinzugefügt wurden, um Veränderungen des Strömungsmusters in verschiedenen Stadien der Regenerationzu beobachten 7; Dieser Ansatz erfordert jedoch eine aufwändige Bildgebung einzelner Zellen und der damit verbundenen Strömungsfelder, nacheinander.
Durch die Verwendung der Bewegung der Zelle selbst als Proxy für den von Zilien erzeugten Fluss wäre es möglich, eine größere Anzahl von Zellen parallel zu analysieren, wobei niedrig aufgelöste Bildgebungssysteme verwendet werden, die mit Hochdurchsatz-Screening-Plattformen kompatibel sind. Dieser Assay kann im Prinzip verwendet werden, um die Entwicklung und funktionelle Regeneration in anderen schwimmenden Organismen im Größenbereich von Hunderten von Mikrometern bis Millimetern zu untersuchen. Abschnitt 1 des Protokolls beschreibt den Aufbau eines Multiwell-Probenobjektträgers, der eine Hochdurchsatz-Bildgebung einer Zellpopulation über einen ganzen Tag ermöglicht. Es werden Details zum Anpassen an die Verwendung mit anderen Zelltypen bereitgestellt. Abschnitt 2 des Protokolls umfasst die Erfassung von Videodaten für diesen Assay, die auf einem Dissektionsmikroskop mit einer digitalen Spiegelreflexkamera durchgeführt werden kann. Abschnitt 3 des Protokolls bietet eine Begehung der Zellverfolgung und der Berechnung der Zellgeschwindigkeit unter Verwendung des MATLAB-Codes (Ergänzende Informationen). In Abschnitt 4 des Protokolls wird erläutert, wie die numerischen Ergebnisse in Diagramme umgewandelt werden, wie in Abbildung 1C-F und Abbildung 2C gezeigt, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Derzeit gibt es viele Partikel- und Zellverfolgungsalgorithmen, von denen einige völlig kostenlos sind. Kosten und Benutzerfreundlichkeit sind oft Kompromisse, die Kompromisse erfordern. Darüber hinaus sind viele der bestehenden Zellverfolgungsprogramme so konzipiert, dass sie die langsame Kriechbewegung von Gewebekulturzellen verfolgen, anstatt die schnelle Schwimmbewegung von Stentor, die sich während des Schwimmens dreht und plötzliche Richtungsänderungen erfahren kann. Nach dem Testen vieler dieser Opti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch das Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS) unterstützt. Wir danken Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo und Skylar Widman für ihre Hilfe bei einigen der vorläufigen Analysen und Codetests. Wir danken Mark Slabodnick für die Diskussion und Anregungen. WFM bestätigt die Unterstützung durch den NIH-Zuschuss R35 GM130327.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
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