세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석
Summary
우리는 밝은 필드 현미경 검사 및 세포 추적을 사용하여 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 세포 집단의 운동성과 행동을 특성화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 Stentor coeruleus 가 잃어버린 구강 장치를 재생할 때 네 가지 행동 적으로 별개의 단계를 통해 전환한다는 것을 보여줍니다.
Abstract
스텐터 코에룰루스 는 단세포 재생 연구를 위한 잘 알려진 모델 유기체이다. 개별 세포에 대한 전사체 분석은 재생 과정 전반에 걸쳐 단계적으로 차별적으로 조절되는 수백 개의 유전자 (많은 구강 장치 (OA)와 관련이없는 것으로 나타났습니다. 새로운 OA의 성장을 향한 세포 자원의 이러한 전신 재구성 및 동원이 차등 유전자 발현의 단계에 시간에 상응하는 이동 및 행동의 관찰 가능한 변화를 초래할 것이라는 가설이 제기되었다. 그러나 S. coeruleus 의 형태 학적 복잡성으로 인해 통계와 시간 척도를 포착하기위한 분석의 개발이 필요했습니다. 사용자 지정 스크립트를 사용하여 짧은 비디오에서 셀을 추적하고 통계가 많은 인구 (N ~ 100)에 걸쳐 컴파일되었습니다. OA를 잃으면 S. coeruleus 는 처음에는 지시 된 움직임에 대한 능력을 상실합니다. 그런 다음 ~ 4 h에서 시작하여 ~ 8 시간까지 속도가 크게 떨어집니다. 이 분석은 운동성 표현형의 스크리닝에 유용한 도구를 제공하며 다른 유기체의 조사에 적합 할 수 있습니다.
Introduction
스텐터 코에룰루스(Stentor)는 크기가 크고, 여러 미세수술 기술을 견딜 수 있는 능력, 실험실 세팅 1,2,3에서 배양의 용이성으로 인해 단세포 재생을 연구하는 데 사용되어 온 잘 알려진 모델 유기체이다. 초기 재생 연구는 스텐터 (Stentor)에서 가장 크고 형태 학적으로 구별되는 특징 인 OA에 초점을 맞추 었으며, 이는 화학 충격 4,5,6에 완전히 흘려집니다. 잃어버린 OA의 De novo 대체는 새로운 막질 밴드의 출현으로 시작됩니다 – 여덟 가지 형태 학적 단계3에 걸쳐 기능적 OA를 형성하기 전에 점차적으로 세포의 앞쪽으로 이동하는 섬모 배열. 이들 단계는 온도에 관계없이 순차적으로 관찰되었으며, 거의 모든 연구5에 대한 보편적인 기준점을 제공한다.
스텐터 재생의 기계론적 분석에는 화학 또는 분자 스크린의 일부로 여러 샘플에 적용할 수 있을 만큼 견고하고 간단한 재생 타이밍을 측정하기 위한 도구가 필요합니다. 세포 기반 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 영상화이며, 이 경우, 재생 동안 새로운 OA의 형성을 이미징한다. 그러나, 이러한 영상-기반 분석은 재생성 구조가 마커로 사용될 수 있는 별개의 분자 성분을 함유할 때 가장 효과적이어서, 이들이 형광 이미지에서 쉽게 검출될 수 있도록 한다. 스텐터 OA의 경우에, 공지된 성분들(섬모, 기저체)은 또한 세포 표면의 나머지 부분에 존재한다; 따라서, OA의 복원을 인식하는 것은 단순히 구성요소의 존재 또는 부재를 찾는 것만으로는 달성될 수 없다.
오히려, OA를 검출하기 위해서는 어떤 형태의 형상 인식이 필요할 것이며, 스텐 터 세포가 종종 빠른 수축 과정을 통해 형태를 변화시킨다는 사실을 감안할 때 이것은 잠재적으로 매우 도전적입니다. 이 논문은 신체 및 OA 섬모의 운동성 활성에 의존하는 재생을위한 대체 분석을 제시합니다. OA가 재생됨에 따라, 새로 형성된 섬모는 위치와 활성의 재현 가능한 변화를 겪으며, 이는 차례로 세포의 수영 운동성에 영향을 미칩니다. 운동성을 분석함으로써, 재생된 구조물의 기능을 정량화함으로써 재생을 정량화하는 “기능적 재생”에 대한 분석을 수행할 수 있다. 재생 중 스텐터 섬모 함수의 이전 분석은 재생7의 여러 단계에서 흐름 패턴의 변화를 관찰하기 위해 외부 매체에 추가 된 트레이서 비드와 결합 된 입자 이미지 속도 측정을 사용했습니다. 그러나이 접근법은 개별 세포 및 관련 유동 필드를 한 번에 하나씩 힘들게 이미징해야합니다.
세포 자체의 움직임을 섬모 생성 흐름의 프록시로 사용함으로써, 고처리량 스크리닝 플랫폼과 호환되는 저해상도 이미징 시스템을 사용하여 더 많은 수의 세포를 병렬로 분석할 수 있을 것이다. 이 분석은 원칙적으로 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 다른 수영 생물에서 발달 및 기능적 재생을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 1은 멀티웰 샘플 슬라이드의 구축을 설명하며, 이는 최대 하루 종일 세포 집단의 높은 처리량 이미징을 허용합니다. 다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 조정하는 방법에 대한 세부사항이 제공된다. 프로토콜의 섹션 2는 디지털 단일 렌즈 반사 카메라를 사용하여 해부 현미경에서 수행 할 수있는이 분석을위한 비디오 데이터의 수집을 다룹니다. 프로토콜의 섹션 3에서는 MATLAB 코드(추가 정보)를 사용한 셀 추적 및 셀 속도 계산에 대한 연습을 제공합니다. 프로토콜의 섹션 4에서는 결과를 쉽게 해석할 수 있도록 그림 1C-F 및 그림 2C와 같이 수치 결과를 플롯으로 변환하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
많은 입자 및 세포 추적 알고리즘이 현재 존재하며 일부는 완전히 무료입니다. 비용과 사용자 친화성은 종종 타협이 필요한 절충안입니다. 또한, 기존의 많은 세포 추적 프로그램은 수영하는 동안 회전하고 갑작스런 방향 변화를 겪을 수있는 스텐터의 빠른 수영 운동보다는 조직 배양 세포의 느린 크롤링 움직임을 추적하도록 설계되었습니다. 이러한 많은 옵션을 테스트 한 후 여기에 제시…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 부분적으로 Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS)에 의해 지원되었습니다. 우리는 Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo 및 Skylar Widman이 예비 분석 및 코드 테스트 중 일부를 도운 것을 인정합니다. 토론과 제안에 대해 Mark Slabodnick에게 감사드립니다. WFM은 NIH 그랜트 R35 GM130327의 지원을 인정합니다.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
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