Analisi dei modelli di motilità dello stentor durante e dopo la rigenerazione dell'apparato orale utilizzando il monitoraggio cellulare
Summary
Presentiamo un protocollo per la caratterizzazione della motilità e del comportamento di una popolazione di cellule da cento micron a millimetri utilizzando la microscopia a campo luminoso e il tracciamento cellulare. Questo test rivela che Stentor coeruleus passa attraverso quattro fasi comportamentalmente distinte quando si rigenera un apparato orale perso.
Abstract
Stentor coeruleus è un noto organismo modello per lo studio della rigenerazione unicellulare. L’analisi trascrittomica delle singole cellule ha rivelato centinaia di geni, molti dei quali non associati all’apparato orale (OA), che sono regolati in modo differenziale in fasi durante tutto il processo di rigenerazione. È stato ipotizzato che questa riorganizzazione sistemica e mobilizzazione delle risorse cellulari verso la crescita di una nuova OA porterà a cambiamenti osservabili nel movimento e nel comportamento corrispondenti nel tempo alle fasi di espressione genica differenziale. Tuttavia, la complessità morfologica di S. coeruleus ha reso necessario lo sviluppo di un test per catturare le statistiche e la scala temporale. Uno script personalizzato è stato utilizzato per tracciare le celle in brevi video e le statistiche sono state compilate su una vasta popolazione (N ~ 100). Dopo la perdita dell’OA, S. coeruleus inizialmente perde la capacità di movimento diretto; quindi a partire da ~ 4 h, mostra un calo significativo della velocità fino a ~ 8 h. Questo saggio fornisce uno strumento utile per lo screening dei fenotipi di motilità e può essere adattato per lo studio di altri organismi.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) è un noto organismo modello che è stato utilizzato per studiare la rigenerazione unicellulare grazie alle sue grandi dimensioni, alla capacità di resistere a diverse tecniche microchirurgiche e alla facilità di coltura in un ambiente di laboratorio 1,2,3. I primi studi di rigenerazione si sono concentrati sulla caratteristica più grande e morfologicamente distinta di Stentor, l’OA, che viene completamente eliminata dallo shock chimico 4,5,6. La sostituzione de novo di un OA perso inizia con l’emergere di una nuova banda membranare, una serie di ciglia che si spostano gradualmente verso la parte anteriore della cellula prima di formare un OA funzionale su otto stadi morfologici3. Questi stadi sono stati osservati in sequenza, indipendentemente dalla temperatura, e forniscono un punto di riferimento universale per quasi tutti gli studi5.
L’analisi meccanicistica della rigenerazione dello stentor richiede strumenti per misurare i tempi di rigenerazione che siano robusti e abbastanza semplici da essere applicati a più campioni come parte di uno schermo chimico o molecolare. Il metodo standard per eseguire un test basato su cellule è l’imaging, in questo caso, l’imaging della formazione di nuova OA durante la rigenerazione. Tuttavia, tali saggi basati sull’imaging sono più efficaci quando la struttura rigenerante contiene componenti molecolari distinti che possono essere utilizzati come marcatori, in modo che siano facilmente rilevati in un’immagine di fluorescenza. Nel caso dello Stentor OA, i componenti noti (ciglia, corpi basali) sono presenti anche sul resto della superficie cellulare; pertanto, riconoscere il ripristino dell’OA non può essere raggiunto semplicemente cercando la presenza o l’assenza di un componente.
Piuttosto, sarebbe necessaria una qualche forma di riconoscimento della forma per rilevare un OA, e questo è potenzialmente molto impegnativo dato il fatto che le cellule Stentor spesso cambiano forma attraverso un rapido processo contrattile. Questo documento presenta un test alternativo per la rigenerazione che si basa sull’attività mobile del corpo e sulle ciglia OA. Mentre l’OA si rigenera, le ciglia appena formate subiscono cambiamenti riproducibili nella posizione e nell’attività, che a loro volta influenzano la motilità di nuoto della cellula. Analizzando la motilità, è possibile eseguire un test per la “rigenerazione funzionale” che quantifica la rigenerazione quantificando la funzione delle strutture rigenerate. La precedente analisi della funzione ciliare di Stentor durante la rigenerazione ha utilizzato la velocimetria dell’immagine delle particelle, combinata con perline traccianti aggiunte al mezzo esterno, per osservare i cambiamenti nel modello di flusso in diversi stadi di rigenerazione7; tuttavia, questo approccio richiede l’imaging laborioso delle singole cellule e dei loro campi di flusso associati, uno alla volta.
Utilizzando il movimento della cella stessa come proxy per il flusso generato dalle ciglia, sarebbe possibile analizzare un numero maggiore di celle in parallelo, utilizzando sistemi di imaging a bassa risoluzione compatibili con piattaforme di screening ad alto rendimento. Questo test può, in linea di principio, essere utilizzato per studiare lo sviluppo e la rigenerazione funzionale in altri organismi nuotatori nella scala da centinaia di micron a millimetri. La sezione 1 del protocollo descrive la costruzione di un vetrino campione multiwell, che consente l’imaging ad alto rendimento di una popolazione di cellule per un massimo di un giorno intero. Vengono forniti dettagli su come regolare l’uso con altri tipi di celle. La sezione 2 del protocollo copre l’acquisizione di dati video per questo test, che può essere eseguita su un microscopio a dissezione con una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo. La sezione 3 del protocollo fornisce una procedura dettagliata del tracciamento delle celle e del calcolo della velocità delle celle utilizzando il codice MATLAB (Informazioni supplementari). La sezione 4 del protocollo spiega come trasformare i risultati numerici in grafici come mostrato nella Figura 1C-F e nella Figura 2C per una facile interpretazione dei risultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attualmente esistono molti algoritmi di tracciamento di particelle e cellule, alcuni completamente gratuiti. Il costo e la facilità d’uso sono spesso compromessi che richiedono un compromesso. Inoltre, molti dei programmi di tracciamento cellulare esistenti sono progettati per tracciare il movimento lento di strisciamento delle cellule di coltura tissutale, piuttosto che il movimento di nuoto veloce di Stentor, che ruota durante il nuoto e può subire improvvisi cambiamenti di direzione. Dopo aver testato molte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato, in parte, dal Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Riconosciamo Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo e Skylar Widman per aver aiutato con alcune delle analisi preliminari e dei test del codice. Ringraziamo Mark Slabodnick per la discussione e i suggerimenti. WFM riconosce il supporto della sovvenzione NIH R35 GM130327.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
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