Kvantitativ analyse af cellekantdynamik under cellespredning
Summary
I denne protokol præsenterer vi de eksperimentelle procedurer i en cellespredningsanalyse, der er baseret på levende cellemikroskopi. Vi leverer et open source beregningsværktøj til uvildig segmentering af fluorescerende mærkede celler og kvantitativ analyse af lamellipodia dynamik under cellespredning.
Abstract
Cellespredning er en dynamisk proces, hvor en celle, der er ophængt i medier, fastgøres til et substrat og samkopierer sig selv fra en afrundet til en tynd og spredt form. Efter celle-substrat vedhæftet fil, cellen danner et tyndt ark lamellipodia stammer fra cellekroppen. I lamellipodien polymeriseres kugleformede actin (G-actin) monomerer til et tæt filamentous actin (F-actin) meshwork, der skubber mod plasmamembranen, hvilket giver de mekaniske kræfter, der kræves for, at cellen kan sprede sig. Især de molekylære spillere, der styrer actin polymerisering i lamellipodia er afgørende for mange andre cellulære processer, såsom celle migration og endokytose.
Da sprede celler danner kontinuerlig lamellipodi, der spænder over hele cellen periferien og vedvarende udvide udad, celle sprede assays er blevet et effektivt redskab til at vurdere kinetik lamellipodial fremspring. Selv om flere tekniske implementeringer af cellespredningsanalysen er blevet udviklet, mangler der i øjeblikket en detaljeret beskrivelse af arbejdsgangen, som vil omfatte både en trinvis protokol og beregningsværktøjer til dataanalyse. Her beskriver vi de eksperimentelle procedurer i cellespredningsanalysen og præsenterer et open source-værktøj til kvantitativ og upartisk analyse af cellekantdynamik under spredning. Når denne protokol kombineres med farmakologiske manipulationer og/eller genhæmningsteknikker, kan den tilpasses en storstilet skærm af molekylære afspillere, der regulerer lamellipodiale fremspring.
Introduction
Lamellipodial fremspring er fremtrædende cytoskeletale strukturer dannet på forsiden af en migrerende celle. I lamellipodia skaber polymerisering af actin ved hjælp af Arp2/3-komplekset og forminer et hurtigt voksende forgrenet actin meshwork, der skubber mod plasmamembranen1,2. Den skubbekraft , der genereres af det actin meshwork , driver fysisk cellen fremad1,3,4,5. Udtømning af Arp2/3-komplekset eller afbrydelse af signalveje , der er afgørende for lamellipodiale fremspring , forringer oftecellemigrationen 6, 7. Selv om migration af lamellipodia-mangelfulde celler også er blevet rapporteret8,9, betydningen af lamellipodi i celle migration er tydeligt som udtømning af denne fremspringende struktur gennemsyrer cellens evne til at bevæge sig gennem komplekse biologiske mikromiljøer6,10.
En væsentlig hindring for at forstå reguleringen af lamellipodi i migrerende celler er den naturlige variation i lamellipodial protrusion kinetik, størrelse og form11,12,13,14. Desuden har nylige undersøgelser vist, at lamellipodia udviser kompleks fremspringende adfærd, herunder svingende, periodiske og accelererende fremspring14,15. Sammenlignet med de meget variable lamellipodier af migrerende celler6,16, lamellipodia dannet under cellespredning er mereensartet 12. Da fremspringende aktivitet spredning og migrerende celler er drevet af identiske makromolekylære forsamlinger, som omfatter en forgrenet actin netværk, kontraktil actomyosin bundter, og integrin-baserede celle-matrix vedhæftninger17,18, sprede celler er blevet udbredt som en model for at undersøge reguleringen af lamellipodia dynamik.
Cellespredning er en dynamisk mekanokemisk proces , hvor en celle i suspension først klæber til et substrat gennem integrinbaserede vedhæftninger17,19,20 og derefter spredes ved at udvide actin-baserede fremspring21,22,23. Under spredningsfasen stikker lamellipodier, der stammer fra cellekroppen, isotropisk og vedvarende med lidt eller ingen tilbagetrækning eller hingst12. De mest anvendte cellespredningsprotokoller er endpoints assays, hvor spredning af celler rettes på forskellige tidspunkter efter plating19,24. Disse assays, selv om hurtig og enkel, er begrænset i deres diagnostiske magt til at opdage ændringer i de dynamiske funktioner i lamellipodia. For at bestemme de molekylære mekanismer, der styrer lamellipodiadynamik, var Sheetz-gruppen banebrydende for brugen af kvantitativ analyse af levende spredeceller og afdækkede mange grundlæggende egenskaber ved cellekantfremspring11,12,22. Disse undersøgelser har vist, at levende celle sprede analyse er en robust og kraftfuld teknik i værktøjskassen i en celle biologi laboratorium. På trods af dette er en detaljeret protokol og open source-beregningsværktøj til en spredning af levende celler i øjeblikket ikke tilgængeligt for cellebiologisamfundet. Til dette formål skitserer vores protokol procedurerne for billeddannelse af levende sprede celler og giver et automatiseret billedanalyseværktøj. For at validere denne metode brugte vi Arp2/3-hæmning som en eksperimentel behandling og viste, at hæmning af Arp2/3-kompleksets funktion ikke arresterede cellespredning, men forårsagede en betydelig reduktion i cellefremspringshastigheden samt stabiliteten af cellekantfremspring, hvilket gav anledning til takkede cellekanter. Disse data viser, at kombinationen af live-celle billeddannelse og automatiseret billedanalyse er et nyttigt værktøj til at analysere cellekant dynamik og identificere molekylære komponenter, der regulerer lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne cellespredningsanalyse giver mulighed for kontinuerlig sporing af morfologiske ændringer(f.eks. cellestørrelse og -form) og cellekantbevægelser(dvs. fremspringshastighed og tilbagetrækningsfrekvens), som er funktioner, der mangler i de fleste cellespredningsprotokoller19,24. Mens almindeligt anvendte endepunkt celle sprede assays giver mulighed for bestemmelse af cellespredning hastighed, disse assays undlader at løse den tids…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskud RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund og University of Toronto XSeed Program.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
References
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
- Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).
- Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
- Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
- Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
- Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
- Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
- Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
- Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
- Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
- Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
- Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
- Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
- Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
- Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).
- Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
- Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
- Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
- Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
